煙花苷對H2O2 致LO2 細胞損傷的保護作用*

姑麗巴哈爾·艾木都拉，張石蕾，劉 濤，姚雨含，趙 軍△

（1. 新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011； 2. 新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，新疆 烏魯木齊 830011；3. 新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所維吾爾藥重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830004）

新疆特色藥材雪白睡蓮可用于感冒發(fā)熱、頭痛咳嗽、心悸不安、咽痛等疾?。?］，是消迪娜兒糖漿、祖卡木顆粒等抗炎、抗病毒復方制劑的主要成分［2］。睡蓮花發(fā)揮藥效的主要成分為黃酮、酚酸等，黃酮類成分煙花苷含量較高，達0.32%［3］。煙花苷化學名為山柰酚-3-O- β-D蕓香糖苷，存在于紅花、睡蓮等多種中藥中，具有抗氧化、抗炎、降血糖和保護神經等多種生物活性［4-6］。睡蓮花煙花苷對有刀豆蛋白A 和半乳糖胺致小鼠急性肝損傷均有較好的保護作用［7-8］，其作用機制與其清除自由基、抑制脂質過氧化及下調促炎細胞因子有關［7］。本研究中采用過氧化氫（H2O2）致LO2 細胞損傷模型觀察睡蓮花煙花苷對肝細胞損傷的保護作用，為睡蓮花及煙花苷的深入開發(fā)提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：Multiskan GO 型自動酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；BA210 型倒置相差顯微鏡（德國Mtic 公司）；BCD-275TMBC 型超低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）；Heracell 型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾公司）；KS12 型超凈工作臺（美國Thermo Scientific 公司）；HHW420 型電熱恒溫水浴鍋（深圳市博大精科技實業(yè)有限公司）；AB104-N 型電子天平（上海梅特勒托利多公司，精度為萬分之一）；KS12 型離心機（美國Thermo Scientific 公司）。

試藥：煙花苷（nicotiflorin，含量大于98.0%，由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所藥物合成室自制）；胎牛血清（FBS，BI 公司，批號為1805172）；RPMI -1640 培養(yǎng)基（批號為AD22797263），磷酸鹽平衡生理鹽水（PBS，批號為AD15805314），胰蛋白酶（批號為J170048），雙抗溶液（批號為J170049），均購自美國Hyclone 公司；溴化二甲噻唑二苯四氮唑（MTT，Coolaber 公司，批號為CM28152114）；二甲基亞砜（DMSO，Vetec 公司，批號為WXBC5269V）；谷氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）和總蛋白定量（BCA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20190110，20190109，20190614，20190111，20190108，20190408）；過氧化氫（H2O2，分析純，北京益利精細化學品有限公司）；其他試劑均為國產分析純。

細胞：人正常肝細胞（LO2 細胞）由新疆醫(yī)科大學中心試驗室提供，經本實驗室傳代后液氮保存。

1.2 方法

1.2.1 試藥準備

MTT 溶液制備：取MTT 25 mg，精密稱定，加入預先裝有5 mL PBS 溶液的燒杯中，使其充分溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾，除菌，分裝于無菌EP 管中，-20 ℃冰箱避光保存。

藥液制備：取煙花苷10 mg，精密稱定，加0.01 mL DMSO 和0.9 mL PBS，配成10 mg/mL 的母液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，除菌，4 ℃保存，臨用前加培養(yǎng)液稀釋至實驗所需的終濃度。

1.2.2 正常肝細胞培養(yǎng)和傳代

細胞復蘇：將凍存的LO2 細胞從-80 ℃低溫冰箱或液氮罐中取出，放到預先加熱好的37 ℃恒溫水浴箱中，快速振搖至凍存的細胞充分溶解，將含有細胞懸液的凍存管置離心機中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入1 ～2 mL DMEM 完全培養(yǎng)液（含10%FBS 與1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)基），輕輕吹打細胞，混勻，移至培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶中再加入3 ～4 mL 完全培養(yǎng)液，混勻，置5%CO2培養(yǎng)箱，37 ℃條件下培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)傳代：待細胞約生長至70% ～80%時，將長滿細胞的培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液完全吸去，盡量吸取干凈，但不觸碰培養(yǎng)皿底。其后用加入2 ～3 mL PBS 洗滌細胞1 ～2 次（動作輕柔，以免將細胞直接從瓶底沖刷下來，引起細胞的損傷及破裂），加入1 mL 0.25%胰酶進行消化，置倒置相差顯微鏡下觀察，當細胞的形態(tài)縮小呈現(xiàn)圓粒狀時，輕輕吹打細胞，再加入2 mL 完全培養(yǎng)液終止胰酶的消化作用，1 000 r/min 行離心5 min，棄去上清液，加入1 ～2 mL DMEM 完全培養(yǎng)液，移液槍勻速吹打離心后的細胞團塊，動作輕柔，均勻吹打，按稀釋比例轉移到新的培養(yǎng)瓶中，以常規(guī)培養(yǎng)條件培養(yǎng)。一般約2 ～3 d 傳代1 次，細胞按1/5 ～1/4 比例傳代（取對數(shù)生長期的細胞用于正式實驗）。

細胞凍存：取預先配制好的凍存液（將DMSO 0.1 mL與0.9 mL FBS 混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用）備用。采用離心方法收集細胞，加1 mL 凍存液，用吸管進行輕打后移至無菌凍存管中，封口，進行標注，置-4 ℃冰箱30 min，移至-20 ℃冰箱30 min，以細胞完全凍住為標準，立即將細胞置-80 ℃冰箱中，24 h 后將細胞轉移到液氮罐中。

細胞計數(shù)：消化細胞制成細胞懸液。將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。吸取細胞懸液10 μL，滴加在蓋片邊緣，使懸液自然充滿蓋片和計數(shù)板之間。靜置1 min，鏡下觀察，計算計數(shù)板4 個大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側和上方，不計右側和下方。按以下公式計算。細胞懸液細胞數(shù)（mL）=4 個大格細胞總數(shù)/4×104。

1.2.3 MTT 法測定細胞活性

取處于指數(shù)生長期的LO2 細胞，加入適量0.25%胰蛋白酶消化約2 min。用完全培養(yǎng)液（含10%FBS 與1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)液）調成細胞密度為5×104/mL的細胞懸液，接種于96 孔板，每孔100 μL。分為空白組、正常對照組（A 組）和不同劑量煙花苷組（C1，C2，C3，C4，C5組，煙花苷質量濃度分別為6.25，12.5，25，50，100 μg/mL），每組設6 個復孔，細胞貼壁后，棄去舊的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液；C 組繼續(xù)在37 ℃及5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24，48，72 h 后，取出培養(yǎng)板；每孔加入5 mg/mL 的MTT 10 μL，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，震蕩10 min，使結晶充分溶解均勻。采用酶標儀于490 nm 波長處測定每孔的吸光度（A）值，重復3 次，計算。細胞存活率（%）=（OD實驗組-OD空白孔）/（OD正常對照組-OD空白孔）×100%。

1.2.4 H2O2致LO2 細胞損傷模型的建立

取處于指數(shù)生長期的細胞，加入適量0.25%胰蛋白酶消化，調成5×104/mL 細胞懸液，接種于96 孔板，每孔200 μL，24 h 后待細胞貼壁生長，棄上清液。分為空白組、正常對照組（A 組）及模型組（B1，B2，B3，B4，B5組，H2O2質量濃度分別為0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol / L），每孔200 μL，每組設6 個復孔，繼續(xù)在37 ℃及5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2，4，8，12，24 h，觀察細胞生長狀態(tài)。采用MTT法測定LO2 細胞活力，并計算細胞存活率。

1.2.5 煙花苷對LO2 細胞損傷的保護作用

取對數(shù)生長期的細胞，加入適量消化液消化，用10%FBS 與1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)液調成細胞密度為5×104/mL 的懸液，將細胞懸液接種于96 孔板中，每孔200 μL，置37 ℃及5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，待細胞貼壁生長，棄上清液。設為正常對照組（A 組）、模型組（B 組）及不同劑量煙花苷組（C1，C2，C3，C4，C5組）（睡蓮煙花苷質量濃度分別為6.25，12.5，25，50，100 μg/mL，每孔200 μL）。A 組、B 組加完全培養(yǎng)液，每組設6 個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；C 組和B 組給予H2O2溶液，每孔200μL（H2O2的終濃度為0.6mmol/L）；A 組加完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h；每孔加入5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使結晶充分溶解均勻。采用酶標儀于490 nm 波長處測定每孔吸光度值（重復3 次），計算細胞存活率。

1.2.6 細胞上清液肝功能及氧化指標測定

取對數(shù)生長期的細胞，加入適量消化液消化，用10%FBS 與1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)液調成細胞密度為5×104/mL 的懸液，將細胞懸液接種于6 孔板，每孔2.0 mL，置37 ℃及5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁生長，棄上清液。分組同1.2.5 項。A 組、B 組加完全培養(yǎng)液，每組設6 個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；C 組和B 組給予H2O2溶液，每孔200 μL（H2O2的終濃度為0.6 mmol/L）；A 組加完全培養(yǎng)液（每孔2 mL），每組設6 個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，觀察細胞生長狀態(tài)，按試劑盒說明書操作，檢測ALT，AST，MDA，SOD，NO 水平。實驗重復3 次。

1.2.7 細胞形態(tài)觀察

用倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)及生長狀況。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學軟件分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用One-way ANOVA分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞毒性試驗結果

與A 組比較，C 組作用24，48，72 h 時均對LO2 細胞增殖無明顯影響和毒性作用，細胞活力正常，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明此質量濃度范圍內對LO2細胞無毒，為安全劑量范圍。詳見表1。

表1 煙花苷對LO2 細胞活力的影響（±s）

表1 煙花苷對LO2 細胞活力的影響（±s）

注：與正常對照組相比，*P ＞0.05。表2 同。

組別給藥劑量（μg/mL）細胞存活率（%）A 組C1 組C2 組C3 組C4 組C5 組6.25 12.5 25 50 100 24 h 100.00±0.1 104.38±0.10*104.32±0.06*103.96±0.05*103.10±0.07*102.68±0.12*48 h 100.00±0.10 100.32±0.07*99.08±0.14*100.73±0.15*102.01±0.12*98.13±0.09*72 h 100.00±0.05 102.47±0.02*104.72±0.02*103.05±0.04*104.12±0.07*96.22±0.13*

2.2 H2O2 致LO2 細胞損傷模型

MTT 檢測結果顯示，隨著H2O2濃度的增高，LO2細胞活力逐漸降低。與B 組比較，A 組細胞貼壁生長正常，細胞大小均勻，胞漿豐富；與A 組比較，B 組濃度在0.4 ～1.2 mmol / L 范圍內對LO2 細胞均造成明顯損傷（P＜0.05），其中0.6 mmol/L H2O2處理LO2 細胞4 h 后，造成的細胞損傷在50% ～60%，細胞皺縮變圓，部分細胞脫落，細胞碎片較多，適合造模條件，詳見表2。故選擇0.6 mmol / L H2O2處理LO2 細胞4 h建立H2O2損傷LO2 細胞模型以探討睡蓮花煙花苷的抗氧化保肝作用。

表2 不同濃度H2O2 處理LO2 不同時間的損傷（±s）

表2 不同濃度H2O2 處理LO2 不同時間的損傷（±s）

濃度 細胞存活率（%）組別（mmol/L）A 組B1 組B2 組B3 組B4 組B5 組0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 2 h 100.00±0.28 64.04±0.70*65.79±0.94*63.02±0.09*57.86±0.39*53.45±0.12*4 h 100.00±0.58 61.82±0.14*57.85±0.07*54.86±0.11*38.61±0.21*30.80±0.13*8 h 100.00±0.42 58.77±0.20*48.13±0.13*36.90±0.12*35.44±0.11*28.68±0.20*12 h 100.00±0.46 55.30±0.24*51.76±0.28*49.62±0.25*34.79±0.28*25.09±0.16*24 h 100.00±0.21 30.04±0.08*27.16±0.09*23.61±0.06*21.03±0.25*21.48±0.06*

2.3 煙花苷對H2O2 致LO2 細胞損傷的保護作用

與A 組比較，B 組細胞存活率下降（P＜0.01）。與B 組比較，睡蓮花煙花苷質量濃度為6.25，12.5，25，50，100 μg/mL 時均能顯著提高LO2 細胞的存活率，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），能顯著降低H2O2導致的細胞活力下降，詳見表3。在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，A 組細胞生長狀態(tài)良好，貼壁較牢，細胞間連接緊密，邊界清楚，大小均勻；B 組細胞數(shù)量明顯減少，細胞邊界不清，甚至損傷破裂，有細胞脫落；與B 組相比，C組細胞數(shù)量和形態(tài)明顯改善，基本接近A 組，詳見圖1。

表3 煙花苷對H2O2 損傷LO2 細胞存活及肝功能、氧化指標的影響（±s）

表3 煙花苷對H2O2 損傷LO2 細胞存活及肝功能、氧化指標的影響（±s）

注：B 組給予0.6 mmol/LH2O2 溶液。與A 組比較，#P＜0.05；與B 組比較，*P＜0.05。

組別給藥劑量（μg/mL）A 組B 組C1 組C2 組C3 組C4 組C5 組6.25 12.5 25 50 100細胞存活率（%）100.00±0.83 48.31±6.27#75.56±3.62*72.82±7.37*71.15±5.39*70.03±3.81*68.70±6.76*AST（U/L）3.53±2.24 26.23±8.45#5.75±1.68*5.54±1.96*5.20±1.70*5.56±1.33*5.23±0.75*ALT（U/L）46.49±3.23 97.40±8.09#50.17±3.95*47.04±5.85*46.89±2.14*46.68±2.50*47.38±5.04*MDA（nmol/mL）40.42±3.00 86.33±3.95#63.37±2.26*59.91±2.47*58.92±3.90*47.46±2.88*47.00±3.66*SOD（U/mg prot）282.03±2.03 172.82±9.62#242.19±1.14*237.75±5.17*226.04±15.96*222.98±8.98*210.85±15.50*NO（μmol/L）1.38±1.27 3.20±1.22#1.66±1.23 1.65±1.20*1.69±0.95*1.81±1.29*1.82±1.14*

2.4 煙花苷對H2O2 損傷LO2細胞肝功能及氧化指標的影響

結果見表3。與A 組比較，B 組可明顯提高LO2 細胞上清液中AST 和ALT 的水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與B 組比較，煙花苷能明顯降低細胞上清液中AST 和ALT 的水平（P＜0.05）。與A 組比較，B 組LO2 細胞上清液中MDA 和NO 含量升高，SOD 含量降低（P＜0.05）；與B 組比較，C 組LO2 細胞上清液中MDA 和NO 含量降低，SOD 含量升高（P＜0.05）。

圖1 細胞形態(tài)圖（×100）

3 討論

在正常生理情況下，體內的氧化還原反應保持著平衡狀態(tài)，氧自由基和抗氧化系統(tǒng)是維持平衡的重要因素。氧自由基大量產生或抗氧化系統(tǒng)功能減弱，均會導致組織細胞的抗氧化損傷。H2O2是體內最常見的一種氧自由基，在多種組織損傷中起著關鍵作用。本研究中以LO2 肝細胞為研究對象，通過藥物對正常細胞及損傷細胞增殖、形態(tài)及生化指標的影響，體外肝毒性通常表現(xiàn)在LO2 細胞活力下降、細胞形態(tài)受損、細胞膜受損通透性增加，評價其防治肝損傷的作用及作用機制［9-10］。采用0.6 mmol/L H2O2作用于LO2 細胞后，引起LO2細胞的氧化性損傷［11-13］，細胞膜和細胞結構遭到破壞，導致其清除自由基能力下降，肝細胞損傷進一步加重，細胞懸液中ALT 和AST 水平顯著上升，細胞內過氧化酶SOD 活性明顯下降［14-16］，脂質過氧化產物MDA 和NO 量顯著增多。煙花苷對H2O2致LO2 細胞損傷有較好的保護作用，能顯著改善細胞的形態(tài)和結構，明顯降低細胞ALT 和AST 的水平，并能明顯提高損傷細胞的SOD 活性，顯著減少MDA 和NO 的含量，減輕H2O2對LO2 細胞的損害。

綜上所述，煙花苷可通過提高抗氧化功能，減輕膜脂質過氧化而發(fā)揮對肝細胞損傷的保護作用。睡蓮花煙花苷對H2O2導致的肝細胞損傷有一定保護作用，為煙花苷的安全應用提供了理論依據(jù)。