普萘洛爾通過PDGFR/Akt途徑抑制肝星狀細胞活化預防肝硬化效果

雷彩紅 張毅

肝纖維化是肝硬化早期病變狀態。有研究發現，肝星狀細胞在肝纖維化進程中起到重要作用，被激活的肝星狀細胞在肝損傷部位激活、增殖并大量分泌I型膠原和III型膠原，從而加快了肝硬化進程[1]。普萘洛爾可用于治療肝硬化靜脈曲張破裂出血，有研究指出其在肝硬化治療中具有潛在應用價值[2]。本研究通過體外實驗發現，普萘洛爾具有抑制肝星狀細胞增殖、促進其凋亡的功效，同時還能夠降低肝星狀細胞I型及III型膠原的分泌，對延緩肝硬化進程具有重要意義，現詳述如下。

資料與方法

一、實驗材料

(一)主要儀器設備 thermo371型細胞培養箱(美國熱電公司) ； Ts2 NIKON相差顯微鏡(日本尼康有限公司)；TG16G臺式高速離心機 (江蘇億能有限公司)；賽多利斯 Practum124-1CN電子天平(德國賽多利斯公司)；Attune NxT流式細胞儀(Thermo Fisher有限公司)；ChemiScope Touch化學發光成像儀(中國勤翔有限公司)。

(二)主要試劑 胎牛血清(美國Gibco公司)；DMEM(美國Gibco公司)；鹽酸普萘洛爾片(中國藥品生物制品檢定所)；人I型膠原ELISA試劑盒(德國默沙克生物有限公司)；人III型膠原ELISA試劑盒(德國默沙克生物有限公司)

(三)研究對象 實驗選用肝星狀細胞購自空軍軍醫大學細胞庫。

二、試驗方法

(一)細胞復蘇及傳代培養 將凍存管取出后置入37℃的溫水中，不斷搖動直至凍存液融化，吸出凍存液并放入5 mL培養液，離心機離心5 min，棄去上清液后，于離心管中再加入5 mL培養液，吹打為細胞懸液轉移至培養瓶中，37℃、5%二氧化碳條件下實施細胞培養，注意每日更換培養液；

觀察細胞鋪滿瓶底后，加入胰酶后使用顯微鏡進行細胞消化情況觀察，待細胞質回縮、細胞間隔增大后倒掉消化液，再加入5 mL血清細胞培養液，吹打瓶壁上的細胞至其成為單細胞懸液，離心7 min，再次加入培養液吹打為新的單細胞懸液，并分裝入不同的培養瓶中繼續培養，實施傳代培養。

(二)細胞分組及干預 將肝星狀細胞分為5組，分別為對照組、生理鹽水組、A組、B組、C組，其中對照組加入細胞和培養液，生理鹽水組加入細胞、培養液和生理鹽水，A組加入細胞、培養液、10 μmol/L的鹽酸普萘洛爾，B組加入細胞、培養液、50 μmol/L的鹽酸普萘洛爾，C組加入細胞、培養液、100 μmol/L的鹽酸普萘洛爾，干預時間均為24 h，培養環境均為37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件。

三、觀察指標及評測標準

(一)細胞形態變化 使用顯微鏡對5組細胞干預前后形態進行觀察，并進行前后及組間的對比；

(二)細胞增殖及凋亡情況 待細胞干預24 h后，加入10 μL的水溶性四唑鹽-1溶液再培養2 h，而后使用M2酶標儀在450 nm波長處測定吸光度，以此推斷細胞增殖程度，其原理為水溶性四唑鹽-1溶液可以被線粒體內的脫氫酶還原為橙黃色，因而細胞增殖越快，則顏色越深，細胞增殖越慢，則顏色越淺；

細胞凋亡情況的測算選擇FACS法，待細胞培養24 h后，棄去細胞上層清液，使用無菌PBS沖洗兩遍后收集細胞沉淀，并使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

(三)細胞I型膠原及III型膠原濃度測定 采用ELISA法分別使用I型膠原及III型膠原試劑盒檢測5組細胞I型膠原及III型膠原濃度，每個指標檢測3次，取平均值待用。

(四)MMP-2及TNF-α水平測定 MMP-2及TNF-α水平的檢測也采用ELISA法實施，待5組細胞干預24 h結束后使用試劑盒分別測定其濃度，每個值檢測3次，并取平均值待用。

(五)VEGF及PDGF水平檢測 VEGF及PDGF水平的檢測同樣采用ELISA法實施，待5組細胞干預24 h結束后使用試劑盒分別測定其濃度，每個值檢測3次，并取平均值待用。

四、統計學方法

結 果

一、細胞形態變化

經觀察發現，處理后對照組及生理鹽水組肝星狀細胞細胞形態與干預前對比變化不大，細胞生長狀態良好，貼壁良好，細胞間隙較小，較為緊密，細胞呈紡錘形或不規則形，大小均勻，胞漿豐富；而A、B、C三組細胞均出現明顯的細胞密度降低，貼壁不牢固，細胞間連接疏松，胞體變細長，且隨著普萘洛爾濃度的增加，細胞死亡現象愈加明顯。

二、細胞增殖及凋亡情況

經檢測發現，生理鹽水組與對照組相比增殖及凋亡無明顯變化(P>0.05)，A、B、C三組細胞均出現增殖降低，凋亡增加現象，與對照組相比差異明顯(P<0.05)，同時隨著普萘洛爾濃度的提升細胞增殖抑制及凋亡現象愈加明顯(P<0.05)，具體數據如表1所示。

表1 5組細胞增殖與凋亡情況對比

三、不同組別細胞I型膠原及III型膠原濃度對比

經檢測發現，生理鹽水組與對照組相比Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原濃度差異不大(P>0.05)，而A、B、C三組Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原濃度明顯比對照組降低(P<0.05)，同時隨著普萘洛爾濃度的提升Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原濃度下降更為明顯(P<0.05)，具體數據如表2所示。

表2 不同組別細胞I型膠原及III型膠原濃度對比

四、不同組別細胞MMP-2及TNF-α水平對比

經檢測對比發現，生理鹽水組與對照組相比MMP-2及TNF-α水平差異不大(P>0.05)，A、B、C三組MMP-2及TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，且隨著普萘洛爾濃度的提升下降幅度越大(P<0.05)，具體數據如表3所示。

表3 不同組別細胞MMP-2及TNF-α水平對比

五、不同組別細胞VEGF及PDGF水平對比

經檢測對比發現，生理鹽水組與對照組相比VEGF及PDGF水平差異不大(P>0.05)，A、B、C三組VEGF及PDGF水平明顯降低(P<0.05)，且隨著普萘洛爾濃度的提升下降幅度越大(P<0.05)，具體數據如表4所示。

表4 不同組別細胞VEGF及PDGF水平對比

討 論

有研究結果指出，可以通過對肝星狀細胞病變進程的監測來推測肝纖維化進程[3-5]。本研究就普萘洛爾通過PDGFR/Akt途徑抑制肝星狀細胞活化進而預防肝硬化的效果進行了探究，結果顯示，相比于未實施干預的對照組細胞及使用生理鹽水干預的生理鹽水組細胞，加用普萘洛爾干預的A、B、C三組肝星狀細胞其形態發生了明顯的變化，細胞密度下降、細胞間連接變疏松，同時A、B、C三組細胞的增殖程度均下降、凋亡率上升，I型及III型膠原濃度下降，MMP-2、TNF-α、VEGF及PDGF水平下降，相比于對照組及生理鹽水組差異明顯。通過分組干預可以發現，普萘洛爾能夠起到一定的抑制肝星狀細胞增殖、加快其凋亡、緩解炎性狀態的作用。本研究分析可通過以下途徑來對肝星狀細胞實施干預：(1)抑制肝星狀細胞增殖；(2)加速肝星狀細胞凋亡；(3)逆轉肝星狀細胞的活化，使其再次進入靜止狀態；結果顯示，普萘洛爾的加入抑制了肝星狀細胞的活化，加速了其凋亡進程，同時進一步組間對比結果顯示，隨著普萘洛爾劑量的增加，肝星狀細胞增殖程度下降，凋亡率升高，這說明普萘洛爾確實具有潛在的抑制肝纖維化作用。本研究結果還提示普萘洛爾對I型膠原、III型膠原、MMP-2、TNF-α的分泌具有抑制作用，這與上文中炎性狀態會加快肝纖維化進程相呼應。而對VEGF及PDGF水平的影響則解釋了普萘洛爾能夠抑制肝星狀細胞增殖的機制，其原因為普萘洛爾能夠通過PDGFR/Akt途徑來降低VEGF及PDGF水平，抑制新生血管的出現，進而起到緩解肝纖維化進程的作用。

總而言之，普萘洛爾具有抑制肝星狀細胞增殖、促進其凋亡的功效，同時還能夠降低肝星狀細胞Ⅰ型及Ⅲ型膠原的分泌，對延緩肝硬化進程具有重要意義。