奶牛妊娠相關糖蛋白BoPAG7和BoPAG8的表達及其結構與功能預測

楊亞軍，何金科，宋勝男，楊寧寧，陳創夫,3*，王震,3*

(1. 石河子大學生命科學學院,新疆 石河子 832000;2. 石河子大學動物科技學院,新疆 石河子 832000；3. 石河子大學西部地區高發人獸共患傳染性疾病防治協同創新中心，新疆 石河子 832000)

妊娠相關糖蛋白(PAGs)是反芻動物滋養細胞產生的一大類分泌型蛋白[1]。PAGs形成了一個大的糖蛋白多態性家族，在牛滋養細胞中表達了超過20個PAG(BoPAGs)成員。第一個分離牛胎盤的BoPAG稱BoPAG1,因蛋白分子量是 67 kD，所以又稱BoPAG 67 kD[2]。PAGs屬于脊椎動物天冬氨酸蛋白酶家族，因此它們與胃蛋白酶、凝乳酶、組織蛋白酶D或腎素等多種酶直接相關[3]。基于這一關系，許多研究分析了一些PAGs中的蛋白水解酶活性[4-6]。它們被懷疑在胎盤-子宮界面潛在生長因子的生化處理中起作用[7]。另一方面，由于催化位點周圍的氨基酸置換，所以牛PAGs沒有酶活性[8-9]。但PAGs仍被認為具有免疫調節和黃體生成作用[10]。盡管PAG被稱為與懷孕相關，但是PAG在維持妊娠和發揮的具體功能目前尚不清楚[11]。根據序列的系統發育分析，PAG可以分為兩類：“古代” PAG和“現代” PAG[12]。“現代”PAG的表達通常僅限于雙核滋養細胞(BNC)，而古代PAG主要在單核滋養細胞(UNC)中表達[1]。BoPAG7屬于“現代”，而BoPAG8屬于“古代”。現代PAGs組的成員可以用作牛血或牛奶中的生化妊娠標記[13]。PAGs著床后立即在懷孕初期分泌出來，在牛受精的第19天，進入母體循環并作為懷孕檢測的特定標記[14]。它們被認為是用于懷孕檢測的首選分子，因為它們在評估胎兒的生存能力和早期胚胎死亡率方面具有其他用途。母體血液中PAGs的水平下降，并在早期胚胎死亡期間逐漸消失，因此成為胚胎存活的獨特生物標記[15]。研究表明，BoPAG7在妊娠早期在胎盤組織中比其他妊娠相關糖蛋白更豐富[11]。通過實施定量檢測發現，妊娠早期胎盤組織中BoPAG8有較高轉錄水平[16]，表明BoPAG7和BoPAG8蛋白在妊娠期發揮著重要的作用。本試驗旨在采取原核表達的方法制備荷斯坦奶牛BoPAG7和BoPAG8蛋白，并對其進行生物信息學分析，為該種蛋白的結構功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

限制性內切酶HindⅢ、BamHⅠ、XhoⅠ，2×TaqMaster Mix，30% Acrylamide，Tris-HCl，SDS，超純RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒等。

1.2 生物信息學分析

通過SignalP 4.1 Server在線軟件預測蛋白信號肽，通過TMHMM Server v.2.0 在線軟件分別預測蛋白的跨膜結構，通過NetNGIyc 1.0 Server在線軟件對蛋白進行糖基化修飾位點進行預測，通過SOPMA在線軟件預測蛋白的二級結構，通過phyre2在線軟件分別預測蛋白三級結構，通過IEDB在線軟件預測分析蛋白質線性B細胞抗原表位，通過STRING在線軟件預測不同蛋白之間的相互作用

1.3 目的基因的獲取

登陸NCBI數據庫分別查找BoPAG7(登錄號：BC133469.1)和BoPAG8(登錄號：NM_176619.3)的DNA序列，通過引物設計軟件Primer5.0進行引物設計，引物前面兩個斜體的核苷酸為保護性堿基、下劃線部分為引物的酶切位點，引物序列詳見表1。通過超純RNA提取試劑盒提取胎盤組織RNA，并通過反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA為模版，PCR擴增BoPAG7和BoPAG8基因，PCR反應體系為：12.5 μL Taq Master Mix(2×)，上下游引物(10 μmol/L)各0.4/μL，cDNA 2/μL，加ddH20至25/μL。反應條件為：95 ℃ 預變性5 min，94 ℃ 變性40 s，退火30 s，72 ℃延伸75 s，30個循環，72 ℃延伸10 min，PCR擴增的目的基因與pMDTM19-T克隆載體連接，轉化至大腸桿菌DH5α中，通過菌液PCR驗證，驗證結果正確后測序。

表1 目的基因擴增所需引物

1.4 表達載體和表達菌株的構建

將測序準確的目的基因與表達載體分別用pET-28a和pET-30a雙酶切后鏈接，將鏈接產物轉化至DH5α大腸桿菌中，通過菌液PCR驗證后通過雙酶切驗證，雙酶切反應體系為：質粒10 μL，10×QuickCut Buffer 2 μL，上下游酶如表1所示，各1 μL，加ddH2O至20 μL，將鑒定成功后的BoPAG7-30a和BoPAG8-28a重組質粒轉入大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)內，再次經過菌液PCR驗證成功后，進行蛋白的原核表達及純化。

1.5 目的蛋白的誘導表達

取BoPAG7-30a和BoPAG8-28a表達菌株接種至LB 液體培養基中，置于搖床(37 ℃、230 r/min)震蕩培養至對數生長期(OD600約為0.4～0.6)，加入異丙基硫代乳苷(IPTG)誘導表達，分別取TPTG誘導0、2、4、6、8 h后的菌液各1 mL，8 000 r/min離心5 min收集菌體，加入80 μL去離子水重懸菌體和20 μL蛋白上樣緩沖液(5×SDS-PAGE Loding Buffer)，震蕩混勻后金屬浴100 ℃作用10 min，經12% 十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后對凝膠進行考馬斯亮藍染液染色、脫色并觀察結果。

1.6 Western Blot檢測

通過半干式轉膜儀轉將SDS-PAGE凝膠上的蛋白樣品用轉移至NC膜上，使用脫脂奶粉封閉NC膜。洗滌緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)洗滌3次，加入Anti His-Tag Mouse Monoclonal Antibody作為一抗，37 ℃ 作用1 h。使用TBST洗滌3次。加入二抗山羊抗鼠IgG-HRP，37 ℃ 作用1 h；TBST洗滌緩沖液洗滌3次。加顯色液顯色。

2 結果

2.1 BoPAG7和BoPAG8蛋白的生物信息學分析

通過SignalP 4.1 Server預測蛋白信號肽如圖1所示，BoPAG7和BoPAG8 N端前15個氨基酸序列為信號肽，通過TMHMM Server v.2.0在線軟件，分別預測并分析蛋白的跨膜結構。結果顯示，2個蛋白都無跨膜結構域(圖2)。故該2種蛋白都為可分泌型蛋白。

圖1 蛋白信號肽預測

圖2 蛋白跨膜區預測

通過NetNGIyc 1.0 Server在線軟件對蛋白進行糖基化修飾位點進行預測，2個蛋白均發生糖基化修飾，其中BoPAG7在Asp57、Asp74、Asp103、Asp125、Asp1825個位點發生N連接糖基化修飾，BoPAG8在Asp218位點處發生N連接糖基化修飾，結果如圖3所示。

圖3 蛋白糖基化預測

通過SOPMA在線軟件預測蛋白的二級結構，結果如圖4所示。所有蛋白主要以α-螺旋、無規則卷曲和延伸鏈組成，所占比例如表2所示。通過phyre2在線軟件分別預測2個蛋白的三級結構，為蛋白的可視化分析提供理論基礎。

圖4 蛋白二級結構預測

表2 蛋白二級結構所占比例

使用IEDB在線軟件預測分析蛋白質線性B細胞抗原表位，結果如圖6。分析結果顯示，BoPAG7和BoPAG8蛋白具有豐富的抗原表位，抗原表位序列見表3和表4所示。

圖5 蛋白三級結構預測

圖6 2種蛋白B細胞抗原表位預測

表3 BoPAG7線性B細胞抗原表位多肽

表4 BoPAG8線性B細胞抗原表位多肽

通過STRING在線軟件預測BoPAG7和BoPAG8蛋白的相互作用，結果如圖7和表5所示。與BoPAG7互作的蛋白包括THSD4、PRP1、PRSS37和CAPZA3，與BoPAG8互作的蛋白為PRP3和BCL7A。

表5 BoPAG7和BoPAG8蛋白相互作用的功能蛋白、途徑和蛋白結構域

圖7 BoPAG7和BoPAG8的蛋白質相互作用

2.2 目的基因的克隆

PCR擴增BoPAG7和BoPAG8基因，大小分別為1 098 bp和1 119 bp(圖8)，經PCR和雙酶切鑒定的陽性菌送公司測序。結果表明，擴增出的BoPAG7和BoPAG8基因與GenBank上發表的堿基序列同源性一致。

M. DNA Marker； A 1～4. BoPAG7基因；B 1～4. BoPAG8基因圖8 基因PCR擴增

2.3 表達載體雙酶切驗證

將表達載體BoPAG7-30a和BoPAG8-28a通過雙酶切，結果如圖9所示，酶切下的基因片段大小與理論值大小相符，表明已成功構建原核表達載體。

M. DNA Marker； A 1. 陰性對照；2、3. BoPAG7-30a雙酶切；B 1. 陰性對照；B 2、3. BoPAG8-28a雙酶切圖9 表達載體雙酶切驗證

2.4 蛋白的誘導表達與純化

將成功構建的表達載體轉入到表達菌株DE3(BL21)感受態細胞中，經IPTG誘導0、2、4、6、8 h后，將表達菌液經12%的SDS-PAGE分析，分別得到大小約為45 kD的BoPAG7蛋白和約46 kD的BoPAG8蛋白，與預期蛋白分子量大小一致。并通過鎳柱親和層析法純化得到較純的目的蛋白，結果如圖10所示。

M.蛋白Marker；A 1. BoPAG7-30a; B 1.BoPAG8-28a DE3空載體；A、B 2～6. 0、2、4、6、8 h誘導菌體；C 1、2. BoPAG7-30a；D 1、2.BoPAG8-28a蛋白純化圖10 蛋白誘導表達與純化

2.5 純化蛋白的驗證

通過 Western blot 分析，對純化蛋白進行驗證。結果顯示，BoPAG7蛋白在約45 kD處、BoPAG8蛋白在約46 kD處均有明顯的條帶，與理論分析值相符(圖11)。

M.蛋白Marker；A.BoPAG7蛋白、B.BoPAG8蛋白圖11 蛋白純化后Western blot分析

3 討論

PAGs又稱為妊娠特異性蛋白B(PSPB)，是一個大家族的糖蛋白，在反芻動物胎盤上皮細胞層(絨毛膜/滋養外胚層)特異表達[17]。PAG蛋白的確切功能可能主要體現在胎盤發生、胚胎保護、母體排斥反應、母體識別和妊娠維持等方面[18]。本研究預測分析了BoPAG7和BoPAG8蛋白二級結構和蛋白三級結構，2個蛋白主要以無規卷曲和延伸鏈為主，對BoPAG7和BoPAG8蛋白進行蛋白互作分析，結果顯示，與BoPAG7互作的蛋白有4個，與BoPAG8互作的蛋白有2個，其中BoPAG7和BoPAG8與催乳素相關蛋白(PRPs)有互作作用，催乳素相關蛋白是牛的非經典催乳素(PRL)生長激素家族的成員，但是，其功能仍然未知[19]。PRP蛋白在妊娠20 d后可在胎盤滋養層雙核細胞中檢測到，據報道bPRP1可能是滋養細胞分化的優良標志物，也是妊娠診斷的候選者[20]。預測到BoPAG8可與BCL7A相互作用，BCL7A缺乏會改變了小腦浦肯野樹突細胞的高度分枝，并損害了運動技能，然而BCL7A的普遍缺失會導致圍產期致死[21]。絲氨酸蛋白酶在消化、凝血、凋亡和免疫系統中發揮著重要的作用，其中，PRSS37是在塑形期精子中出現而在成熟精子中消失的一種功能未知的絲氨酸蛋白酶[22]。但BoPAG7和BoPAG8的具體的生物學功能仍需深入研究。滋養層雙核細胞(BNCS)在胞質顆粒中儲存多種糖蛋白，并具有特定的糖基化模式[17]。糖基化確實在PAGs的抗原性中起作用，并且在懷孕期間也可能起作用[23]。本研究成功預測到BoPAG7有5個位點發生N連接糖基化修飾，分別是Asp57、Asp74、Asp103、Asp125和Asp182，BoPAG8在Asp218位點處發生N連接糖基化修飾。信號肽預測分析顯示，BoPAG7和BoPAG8 N端前15個氨基酸序列為信號肽，且無跨膜結構，表明這該蛋白為可分泌型蛋白。對BoPAG7和BoPAG8蛋白進行B細胞抗原表位預測分析，結果顯示，BoPAG2含有多個線性表位，這表明其作為抗原能引起良好的免疫應答。

綜上，本研究通過生物信息學預測分析，預測到BoPAG7和BoPAG8蛋白分別有5個和1個N鏈接糖基化，同時對其蛋白的結構和B細胞抗原表位進行預測分析，并且對不同蛋白間互作進行預測分析。通過原核表達并純化獲得了BoPAG7和BoPAG8蛋白，為BoPAG7和BoPAG8蛋白抗體的制備和功能的研究提供了基礎。