miR-150和HMGA2在結直腸癌中的表達和臨床意義

張忠臣 吳麗麗 王國平

結直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，發病率高，尤其近年來在青年中發病率呈增高趨勢[1]。高遷移率蛋白A2（high mobility group protein A2，HMGA2）是高遷移率蛋白A（因在聚丙烯酰胺凝膠電泳中遷移速度快而得名[2]）家族成員之一，它可通過改變染色體結構或與其他轉錄因子相互作用，參與多種生物學過程，調控基因的轉錄和表達，包括調控細胞增殖和凋亡。除胚胎早期和未分化組織外，它在正常組織中含量較低。多種研究表明HMGA2異常表達與乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌及卵巢癌等多種腫瘤的發生、進展及預后密切相關[3-6]，在結直腸癌的研究中也發現HMGA2表達異常，可能與疾病的進展和預后有關[7]。miRNA（miR）是一種重要的表觀遺傳調控因子，它通過抑制mRNA的翻譯或降解mRNA來影響細胞增殖周期及凋亡。越來越多的證據表明miR的異常表達在結直腸癌發生、發展中起著至關重要的作用[8-11]。生物信息學分析顯示miR-150與HMGA2的3′-端非翻譯區（3′-UTR）基因序列具有靶向互補關系。本研究探討miR-150和HMGA2在結直腸癌細胞增殖周期中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 人結直腸癌SW480細胞株和正常結腸上皮細胞（FHC）均購自上海珍妮生物技術公司；細胞培養基（RPMI 1640）、減血清培養基（Opti-MEM）、杜氏培養基（DMEM）、FBS和青鏈霉素均購自以色列生物有限公司；脂質體RNA iMAX轉染劑購自美國皮爾斯公司；逆轉錄酶定量PCR、逆轉錄試劑盒和SYBR Green染料均購自日本大阪東洋生物公司；HMGA2小干擾RNA購自上?；蛑扑幱邢薰?；miR核苷酸片段購自廣州瑞博生物有限公司；HMGA2兔抗人抗體購自美國CST公司；小鼠抗細胞周期蛋白A抗體購自美國圣克魯斯生物科技公司；山羊抗兔抗體IgG（H+L）購自美國劍橋Abcam生物技術公司；過氧化酶標記抗鼠兔二抗購自美國杰克遜免疫研究所；細胞計數試劑盒8（CCK-8）購自武漢博士德公司；TRIZOL試劑、人胚腎細胞（HEK293T）及細胞周期檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術公司；熒光素酶基因載體pLUC購自美國奧斯汀Ambion公司。

1.2 細胞分組和轉染 將人結直腸癌SW480細胞和FHC分別分為SW480細胞組和FHC組。FHC在DMEM中培養，SW480細胞于添加10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI 1640中培養，SW480細胞呈對數生長期時，將細胞鋪至6孔板，貼壁24 h后將SW480細胞分為miR-150對照組、miR-150模擬體組、小干擾對照組、小干擾HMGA2組和miR-150模擬體聯合小干擾HMGA2組共5組。miR-150模擬體組細胞轉染miR-150模擬體；小干擾對照組細胞轉染小分子干擾RNA序列（正鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，負鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′）；小干擾 HMGA2組細胞轉染HMGA2特異性siRNA序列（正鏈：5′-CAGCCUGAAUAACUUGAACTT-3′，負鏈：5′-GUUCAAGUUAUUCAGGCUGTT-3′）；miR-150模擬體聯合小干擾 HMGA2組細胞共轉染miR-150模擬體及HMGA2特異性siRNA序列。轉染時采用Opti-MEM培養液分別稀釋核苷酸片段和脂質體RNAiMAX轉染劑，在室溫下培養5 min后，將它們混合并添加到細胞中，48 h后收集細胞進行檢測。

1.3 SW480細胞組和FHC組miR-150、HMGA2和周期蛋白A（Cyclin A）表達水平檢測 用Trizol試劑提取總RNA并采用RT-PCR法進行檢測，所使用的引物如下：miR-150PF:5′-ATAAAGTGCTGACAGTGCAGATAGTG-3′；miR-150PR:5′-TCAAGTACCCACAGTGCGGT-3′；U6PF:5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′；U6PR:5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′；HMGA2PF:5′-ACCCAGGGGAAGACCCAAA-3′；HMGA2PR:5′-CCTCTTGGCCGTTTTTCTCCA-3′；CyclinAPF:5′-ACATGGATGAACTAGAGCAGGG-3′；CyclinAPR:5′-GAGTGTGCCGGTGTCTACTT-3′；β-actinPF:5′-GAACCCTAAGGCCAAC-3′；β-actinPR:5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′。RT-PCR反應體系包括2×SYBR Green RT-PCR預混液10 μl，上下游引物（10 μm/l）各 0.8 μl，2 μg 互補 DNA和蒸餾水，分別在ABI7500上進行95℃15 s、60℃30 s、74℃30 s 40個循環的PCR反應，然后用凝膠電泳法檢測SW480細胞組和FHC組miR-150、HMGA2和Cyclin A的表達水平。

1.4 miR-150對照組和miR-150模擬體組HEK293T熒光活性的檢測 采用熒光素酶報告系統檢測兩組細胞的熒光活性。生物信息學分析顯示miR-150與HMGA2的3′-UTR基因序列具有靶向互補關系，取適量對數生長期的SW480細胞，提取細胞總RNA，逆轉錄cDNA，以cDNA為模板，根據HMGA2的編碼序列設計含有EcoR1和BamH1限制性內切酶位點的引物序列，通過PCR反應擴增并回收HMGA2編碼片段，將含有HMGA2-3′-UTR全長片段的PCR產物連接到pLUC質粒DNA并將基因轉化成DH5α細胞，質粒經測序確認并分別命名為pLUC-HMGA2-3′-UTR-野生型和pLUC-HMGA2-3′-UTR-突變型，再用脂質體RNA i-MAX 轉染劑將 pLUC-HMGA2-3′-UTR-野生型、pLUCHMGA2-3′-突變型分別和miR-150模擬體共轉染HEK293T，培養48 h后，按說明書使用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測兩組HEK293T的熒光活性。

1.5 5組轉染細胞G0/G1、G2/M、S期細胞比例的檢測 采用碘化丙啶染色法的流式細胞術。用酶收集細胞并轉移到15 ml離心管中，先以1 000 r/min離心5 min，再將細胞用70%乙醇固定后4℃下過夜，之后添加50 μg/ml碘化丙啶在37℃避光保存15 min，按上述處理后采用流式細胞儀檢測樣品。

1.6 5組轉染細胞的細胞活力檢測 采用CCK-8法。用96孔板細胞接種，每孔104細胞。培養48 h后,每孔添加10 μl CCK-8溶液，4 h后用微平板光掃描儀在450 nm波長處測定其吸光度（OD），OD值可反映細胞密度，根據OD值繪制細胞細胞生長曲線。

1.7 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料用±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SW480細胞組與 FHC組 miR-150、HMGA2和Cyclin A表達水平比較 SW480細胞組較FHC組miR-150表達水平下降，而HMGA2和Cyclin A表達水平升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 SW480細胞組與FHC組miR-150、HMGA2和Cyclin A表達水平比較

2.2 miR-150對照組和miR-150模擬體組HEK293T熒光活性的比較 與miR-150對照組比較，miR-150模擬體組pLUC-HMGA2-3′-UTR-野生型HEK293T熒光活性明顯為低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.3 5組轉染細胞G0/G1、G2/M、S期細胞比例的比較 與miR-150對照組比較，miR-150模擬體組、小干擾HMGA2組和miR-150模擬體聯合小干擾HMGA2組G0/G1期細胞比例均明顯為高，而G2/M、S期細胞比例均明顯為低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3。

表2 miR-150對照組和miR-150模擬體組人胚腎細胞熒光活性的比較

表3 5組轉染細胞G0/G1、G2/M、S期細胞比例的比較

2.4 5組轉染細胞的細胞活力比較 與miR-150對照組及小干擾對照組比較，miR-150模擬體組、小干擾HMGA2組、miR-150模擬體組聯合小干擾HMGA2組的OD值均減弱，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 5組轉染細胞的細胞活力比較

3 討論

結直腸癌是我國常見的惡性腫瘤，年發病率高達28.2/10萬，病死率為13.61/10萬，每年新發38.8萬例，病死18.7萬例[12]。此外，結直腸癌預后較差，3年生存率約為60%，5年生存率低于40%，因此尋找結直腸癌發病機制中的分子靶點對早期診斷和預后具有重要意義。

HMGA2是一種無轉錄活性的非組蛋白染色體蛋白，它可以通過改變染色體的空間結構或與蛋白質相互作用來調控基因轉錄、復制和修復DNA損傷[13]。Cyclin A是細胞周期的正向調控因子，能與細胞周期素依賴性激酶1、細胞周期素依賴性激酶2相互作用，促進細胞進入S期，加速G2/M相變，在細胞周期中起著至關重要的作用。Leung等[14]發現HMGA2的過度表達常在惡性腫瘤中出現，主要在包括結直腸癌在內的胃腸道腫瘤中過表達。有研究表明，miR-150表達降低與結直腸癌發生相關，并可能影響結直腸癌進展[11]。生物信息學分析顯示miR-150與HMGA2的3′-UTR具有互補的靶向關系。因此本研究旨在探討miR-150在調控HMGA2表達及對結直腸癌細胞增殖的影響。

本研究顯示，與FHC組相比，SW480細胞組HMGA2表達水平升高，而miR-150表達水平下降。有研究表明，HMGA2在結直腸癌組織中異常上調與腫瘤分期、遠處轉移及預后不良有關[15-16]，本研究發現在結直腸癌組織中HMGA2升高，與其結果一致。Gattolliat等[17]報道miR-150在結腸腺瘤或結直腸癌組織中的表達水平明顯低于正常結腸黏膜，Ma等[18]發現結直腸癌組織中miR-150表達水平較鄰近正常組織明顯降低，且miR-150表達水平較低的患者生存率更低，化療敏感性更差。本研究發現SW480細胞組中miR-150表達水平下降，與上述結果一致。與FHC組比較，在SW480細胞組中miR-150表達水平明顯下降，而HMGA2和Cyclin A表達水平升高，這表明下調miR-150表達水平可能上調HMGA2和Cyclin A表達水平，并進一步促進結直腸癌細胞增殖，加快細胞周期。本研究進一步分析表明，miR-150模擬體和（或）小干擾HMGA2阻滯細胞周期G0/G1期，抑制SW480細胞增殖。Wu等[19]研究表明，HMGA2過表達明顯促進了結直腸癌細胞的侵襲和轉移，而HMGA2的表達下調則表現出相反的作用。本研究也表明HMGA2表達下調可降低結直腸癌細胞的惡性特征。

綜上所述，本研究顯示miR-150可通過抑制HMGA2及Cyclin A的表達，誘導結直腸癌細胞周期阻滯，抑制細胞增殖。