去甲斑蝥素對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥小鼠骨微結(jié)構(gòu)影響的研究

黃飛日 蘇忠良 楊知帆

骨質(zhì)疏松癥是一種常見(jiàn)的全身性骨骼疾病，與年齡、性別、遺傳等因素相關(guān)[1-2]，其特征是骨量減少和微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性和骨折易感性增加[3]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。骨質(zhì)疏松性相關(guān)疾病的發(fā)病率和病死率逐年提高，且治療成本巨大，將是醫(yī)療保健系統(tǒng)的一個(gè)巨大負(fù)擔(dān)[4]，是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。絕經(jīng)后婦女是罹患骨質(zhì)疏松癥的重要人群，其發(fā)病概率遠(yuǎn)大于男性，主要是由于雌激素缺乏所致。雌激素的缺乏將導(dǎo)致骨吸收與骨生成穩(wěn)態(tài)被打破，造成骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨量減少、骨強(qiáng)度下降，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[5]。通過(guò)手術(shù)摘除卵巢的方法可有效制備骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型[6]。去甲斑蝥素是我國(guó)傳統(tǒng)中藥斑蝥素的重要衍生物、蛋白磷酸酶2抑制劑[7]。現(xiàn)已證實(shí)去甲斑蝥素可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[8-10]，并且可通過(guò)抑制蛋白磷酸酶2促進(jìn)成骨細(xì)胞生成和抑制骨吸收[11]。本研究觀察去甲斑螯素對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥小鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響，探討其防治骨質(zhì)疏松癥的可行性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 去甲斑螯素購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；無(wú)水乙醇購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；甲醛、0.9%氯化鈉注射液、水合氯醛均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1 ml注射器購(gòu)自北京英偉達(dá)科技有限公司。電子天平購(gòu)自上海精密儀器儀表有限公司，顯微CT機(jī)購(gòu)自比利時(shí)SkyScan公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 雌性C57BL-6J 2月齡小鼠40只，體重（21±2）g，所有小鼠均購(gòu)自蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。予自來(lái)水和無(wú)菌飼料喂養(yǎng),墊料隔天換1次，晝夜各12 h。將40只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成低劑量組、高劑量組、假手術(shù)組和去卵巢組4組，每組10只。實(shí)驗(yàn)經(jīng)溫州市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南。

1.3 動(dòng)物造模制作 各組小鼠采用3.6%水合氯醛按0.01 ml/g濃度腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，在小鼠背部備皮，碘伏消毒，于兩側(cè)髂嵴水平處沿后正中線向上作一縱形皮膚切口，長(zhǎng)約1 cm，鈍性分離皮下組織、肌肉，切開(kāi)深處腹膜，進(jìn)入腹腔后充分暴露手術(shù)視野，可見(jiàn)粉紅色桑葚樣卵巢及淡紅色輸卵管，將其鈍性游離。去卵巢組、低劑量組和高劑量組小鼠建立小鼠骨質(zhì)疏松模型，即在距卵巢5 mm處結(jié)扎輸卵管及伴隨血管，切除卵巢及周?chē)窘M織，然后按相同的方法摘除對(duì)側(cè)卵巢，在確保摘除雙側(cè)卵巢后，逐層縫合腹膜及皮膚，碘伏消毒，予以青霉素1萬(wàn)U肌肉注射預(yù)防感染。假手術(shù)組小鼠麻醉后切開(kāi)皮膚，不做其他處理即予以縫合、消毒并肌肉注射青霉素（劑量同上）。

1.4 藥物干預(yù) 卵巢摘除術(shù)后每周小鼠稱體重1次，并于第8周起開(kāi)始給藥干預(yù)。將相應(yīng)劑量的去甲斑螯素[低劑量組小鼠為10 mg/（kg·d），高劑量組小鼠為20 mg/（kg·d）]充分溶于0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液并注入腹腔，連續(xù)4周，每周按照體重變化及時(shí)調(diào)整給藥劑量。假手術(shù)組和去卵巢組均予0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。

1.5 骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)檢測(cè) 給藥干預(yù)4周后，用頸椎脫臼法處死各組小鼠，取小鼠完整股骨，剝離附著的肌肉及結(jié)締組織，于10%甲醛溶液中固定24 h，然后保存于70%乙醇溶液中。檢查時(shí)，將小鼠股骨取出，紙巾吸除多余溶液，用紗布隔開(kāi)，置于顯微CT機(jī)泡沫盒中，掃描參數(shù)設(shè)置：電壓 50 kV，電流 200 μA，過(guò)濾片 0.5 mmAl，掃描精度為9 μm。圖片經(jīng)過(guò)3D重建后，觀察小鼠股骨遠(yuǎn)端骨微結(jié)構(gòu)變化并分析其相關(guān)參數(shù)：（1）骨小梁骨密度；（2）骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）：感興趣區(qū)內(nèi)骨組織體積除以總體積，是標(biāo)化后的骨體積參數(shù)；（3）骨小梁數(shù)量（Tb.N）：用單位體積內(nèi)骨小梁數(shù)量，來(lái)反映骨小梁數(shù)量變化；（4）骨小梁間隔（Tb.Sp）：?jiǎn)挝惑w積內(nèi)骨小梁之間的間隔，體現(xiàn)多孔骨組織骨小梁間距離；（5）骨小梁厚度（Tb.Th）：?jiǎn)挝惑w積內(nèi)骨小梁的厚度，描述骨小梁厚度的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。圖像分析軟件采用Image.Pro Plus 5.1軟件包。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

去卵巢組骨小梁骨密度、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均低于假手術(shù)組，Tb.Sp高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；低劑量組與高劑量組骨小梁骨密度、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均高于去卵巢組，Tb.Sp均低于去卵巢組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表1。

3 討論

圖1 各組小鼠股骨遠(yuǎn)端顯微CT圖像

表1 各組小鼠股骨遠(yuǎn)端區(qū)域骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較

骨質(zhì)疏松癥是一種常見(jiàn)的全身性骨病，骨量和骨密度下降是本病的主要特征，正常骨代謝是破骨細(xì)胞骨吸收和成骨細(xì)胞骨形成之間的動(dòng)態(tài)平衡[12-13]，成骨細(xì)胞活性降低以及破骨細(xì)胞的過(guò)度形成和活化是導(dǎo)致骨量和骨密度下降的主要因素[14]。雌激素缺乏是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的主要危險(xiǎn)因素，雌激素可直接作用或通過(guò)成骨及破骨細(xì)胞的雌激素受體[15]間接調(diào)節(jié)骨基質(zhì)蛋白（酸溶原膠原蛋白等）、細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 等）和轉(zhuǎn)錄因子等促進(jìn)成骨，抑制蛋白水解酶的產(chǎn)生和骨吸收[16]。因此，雌激素水平的降低可導(dǎo)致骨形成受抑，骨吸收亢進(jìn)，使骨代謝的穩(wěn)態(tài)被打破，導(dǎo)致骨密度的降低、骨質(zhì)疏松的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中在摘除小鼠卵巢后，股骨遠(yuǎn)端骨量顯著丟失，骨微結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞。

蛋白磷酸酶2是一種主要的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，是由結(jié)構(gòu)亞單位A、調(diào)節(jié)亞單位B和催化亞單位C構(gòu)成的異三聚體，廣泛參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等多種細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程[17]。且據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，蛋白磷酸酶2選擇性抑制劑可通過(guò)抑制核因子 κB（NF-κB）受體活化因子配體誘導(dǎo)的 NF-кB 和c-Jun N-末端激酶信號(hào)通路來(lái)抑制破骨細(xì)胞生成并減輕破骨細(xì)胞的吸收[18]。去甲斑蝥素作為一種蛋白磷酸酶2抑制劑，本文旨在研究其對(duì)去勢(shì)小鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響，探討其防治骨質(zhì)疏松癥的可行性。

通過(guò)摘除小鼠雙側(cè)卵巢后成功建立了小鼠骨質(zhì)疏松模型，予以一定濃度去甲斑螯素干預(yù)4周后，采用顯微CT三維重建小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁微結(jié)構(gòu)，觀察和分析評(píng)估小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁骨密度、Tb.N、Tb.Th、Th.Sp，表明去甲斑螯素可以有效保護(hù)摘除卵巢后引起的骨量丟失，通過(guò)劑量依賴性減少骨微結(jié)構(gòu)的破壞和丟失。

綜上所述，去甲斑螯素明顯改善了去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥小鼠的骨微結(jié)構(gòu)，減少了骨量的丟失，是治療骨質(zhì)疏松癥的一種潛在選擇。