針刺治療對CUMS抑郁大鼠行為學和血清代謝組學的影響

徐雪嬌，李天英，田家華，李欣，劉俊麟，馬蕓瑄，喬延盈，孫謙

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

抑郁癥作為一種嚴重影響患者生活和工作的神經精神疾病，其發病率呈逐年上升趨勢，人們對其治療越發重視[1-3]。西藥治療具有耐藥、副作用大等特點，尋找有效安全的治療方法刻不容緩。《黃帝內經》中《靈樞·癲狂》篇記載了采用針刺放血的方法治療情志病。目前臨床上針刺治療抑郁癥具有較好的臨床療效[4-6]，但機制不清。百會穴位于顛頂，為督脈上的穴位，總督人體一身陽氣，為調節人體陰陽平衡的要穴，主治癲狂癇類病證。印堂穴位于眉心，為經外奇穴，具有調暢氣機，養心安神之效。臨床上常用百會和印堂治療抑郁癥[7-9]。

近年來，CUMS模型廣泛應用于精神疾病的研究中[10-11]，它能夠模擬人類在社會環境中的各種不可預見性應激。代謝組學作為能夠檢測內源性小分子代謝物的技術手段，廣泛地應用于各種體液以及組織的檢測[12-13]。本實驗采用GC-MS平臺，檢測血清樣本，探尋針刺治療對CUMS大鼠血清代謝的影響，并試圖闡明相關代謝途徑。

1 材料和方法

1.1 動物

將所有SD大鼠(雄性)單籠飼養，提供標準動物飲食和飲水以及飼養環境。

1.2 實驗過程

見圖1，所有大鼠練習飲用蔗糖水(2%)，每周進行1次SPT。在第0周，將18只大鼠分成12只CUMS，其余為對照。CUMS進行為期4周的造模，對照組正常喂養即可。每周進行SPT，將CUMS分為CUMS組(6只)與針刺組(6只)，針刺組進行治療，SPT每周進行，第7周結束時進行OFT。

圖1 實驗過程圖

1.3 造模流程

具體操作有禁水，空瓶，白噪音，濕墊料等，連續2 d采用不同的刺激方法[14]。

1.4 行為學

1.4.1 糖水消耗實驗

糖水消耗實驗(SPT)測定每只大鼠在24 h內飲用蔗糖水占總飲水量的百分比。見圖1。

1.4.2 曠野實驗

曠野實驗(OFT)曠野箱為黑色開放式長方體(100 cm×100 cm×40 cm)。將所有大鼠依次放置在角落，放入大鼠前將前一只大鼠糞便及尿液清理干凈。每只大鼠有30 s的適應時間，視頻計算機跟蹤系統(SMART,Panlab SL,Barcelona,Spain)記錄5 min運動總距離和中心運動時間。

1.5 針刺

使用華佗針具針刺印堂和百會，刺入約5～6 mm，停留15～20 min[15]。

1.6 取材

戊巴比妥麻醉，采血，室溫下靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，吸取上清到EP管中，存放于-80 ℃冰箱。

1.7 代謝組學

1.7.1 樣品準備

將血清樣本從-80 ℃冰箱中取出，解凍，50 μL血清移至1.5 mL EP管中并加入20 μL的內標后持續10 s使其搖勻，再加入150 μL甲醇-乙腈混合溶液(2∶1, v∶v)，持續1 min搖勻，使蛋白充分沉淀后，于-20 ℃靜置約10 min。冰水浴超聲持續5 min，此時取100 μL上清，揮干樣品；加入15 mg/mL的甲氧胺鹽酸鹽吡啶80 μL，渦旋震蕩后進行肟化反應。

1.7.2 色譜

本實驗選用安捷倫公司儀器。衍生化后將樣品進行分析(1 μL)。分離采用毛細管柱，下一步質譜分析。

1.7.3 質譜

質譜檢測溫度為安捷倫儀器默認溫度。SCAN：m/z 50～600。

1.8 數據分析

采用SPSS 24.0，P<0.05具有統計學意義。數據處理后導出矩陣，可獲得基本數據。再導入程序。樣本間的分布情況和分析過程中是否穩定采用PCA分析，(O)PLS-DA區分各組代謝差異。還需進一步檢驗模型的過擬合程度。

2 結果

2.1 針刺對SPT和OFT的影響

4周CUMS造模結束后，造模大鼠SPT顯著降低(P<0.01)。3周針刺后，CUMS+針刺組與CUMS組相比，糖水消耗和曠野中心運動時間顯著提高(P<0.01)。CUMS+針刺組與對照組相比，糖水消耗與曠野中心運動時間無差異。3組的曠野運動總距離無差異。見圖2、3，表1、2。

注:4周刺激后，與對照組相比，**P<0.01;針刺治療結束后，與CUMS組相比，##P<0.01圖2 糖水消耗實驗結果

表1 糖水消耗值比較

表2 曠野運動總距離和中心運動時間

2.2 針刺CUMS大鼠血清代謝組學的變化

如圖4，PCA顯示組間區分。進一步采用PLS-DA和OPLS-DA分析以最大程度地區分。OPLS-DA表明組間的代謝表型具有顯著差異。R2X=0.263,R2Y=0.952,Q2=0.75，表明該模型可信。通過OPLS-DA負載圖我們得到具體差異，共77種。我們首先找到CUMS組與對照組之間存在顯著差異的代謝物，再將這些代謝物在CUMS組與CUMS+針刺組中比較，若經過針刺治療后無差異，則表明針刺能夠將這些差異代謝物逆轉。針刺治療CUMS大鼠結束后，血清中L-蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、吲哚乙酸和牛磺酸水平得到了逆轉。見表3。

圖4 PCA示意圖

表3 血清差異代謝物

2.3 相關代謝通路

代謝數據庫和基因組數據庫將逆轉代謝物與通路相關聯并確定影響因子。主要參與：①丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝；②牛磺酸和低牛磺酸代謝；③甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；④氨酰基-tRNA生物合成；⑤D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，如圖5、6。

圖5 影響因子

圖6 相關代謝通路示意圖

3 討論

本研究成功造模后采用針刺手段進行干預，經過治療后，抑郁大鼠的行為學得到了顯著的改善，表明針刺治療能改善抑郁焦慮行為。檢測三組血清，找到差異代謝物。其中6種代謝物針刺后發生逆轉：L-蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸、吲哚乙酸和牛磺酸。逆轉的代謝物主要分為3大類：氨基酸類(L-蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-絲氨酸、L-谷氨酸)，吲哚基羧酸(吲哚乙酸)和有機磺酸(牛磺酸)。氨基酸代謝異常在抑郁癥中較為常見。DENG等[16]在研究抑郁癥發生機制中，對食蟹猴抑郁模型進行代謝組學研究，發現腦脊液中蘇氨酸、絲氨酸和天冬氨酸代謝紊亂。有文獻報道在腎上腺皮質激素誘導的抑郁鼠尿液中L-蘇氨酸代謝紊亂，這種改變在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑中起關鍵作用[17]。谷氨酸作為興奮性神經遞質的重要組成，它的代謝在抑郁癥中發揮重要作用[18-19]。我們的研究表明，針刺可能通過降低谷氨酸的興奮性發揮抗抑郁作用。牛磺酸是一種β氨基酸，參與滲透調節，信號轉導和神經傳遞調節等生理活動。已經證實牛磺酸對大腦發育有保護作用，飲食中牛磺酸的含量與抑郁癥的調節具有相關性[20]。在疏肝和胃湯的抗抑郁研究中，抑郁組大鼠下丘腦中吲哚乙酸含量顯著降低[21]。本研究中抑郁組大鼠血清中吲哚乙酸含量升高，在某種程度上反應了抑郁大鼠中樞與外周吲哚乙酸含量可能存在差異，提示我們在下一步工作中可同時檢測針刺對中樞和外周代謝水平的調節。本研究通過對逆轉代謝物參與代謝通路的研究，發現針刺可能是調節了血清中氨基酸合成、氨基酸代謝與牛磺酸代謝。通過代謝平臺找出針刺逆轉的血清代謝物及其參與的代謝途徑。接下來，我們將研究針刺對CUMS大鼠腦組織代謝的影響并結合中樞與外周代謝數據進行分析，從而完善針刺治療的相關數據。