基于Plackett-Burman及Box-Behnken試驗方法優化新型毒品卡痛檢測試劑卡

熊瑤　王海劍　陸維克　高飛

摘??要：目的：優化卡痛試劑卡玻纖工藝。方法：以卡痛試劑卡陰性質控結果為指標，采用Plackett-Burman設計篩選卡痛試劑卡玻纖體系的主要影響因素;再以陰性質控結果為評價指標，采用?Box-Behnken設計對影響卡痛試劑卡陰性質控結果的主要因素進一步優化，對實驗數據進行多元線性回歸、二項式擬合，分析預測最佳工藝。結果：卡痛試劑卡玻纖體系的最佳工藝條件為：Na2HPO4添加量為0.05M，Chemal?LA-9添加量為8.74g/L，pH7.0。結論：采用Plackett-Burman和Box-Behnken設計法優化卡痛試劑卡科學合理，優選的工藝穩定可靠，為卡痛試劑卡的工業化生產提供了可靠依據。

關鍵詞：卡痛;膠體金;Plackett-Burman試驗;Box-Behnken試驗

卡痛（Kratom）葉為茜草科的熱帶常綠樹[1]，原生于泰國、馬來西亞、印度尼西亞、緬甸等東南亞國家，其主要成分為生物堿帽柱木堿和7-羥基帽柱木堿[2]。其中主要成分帽柱木堿為白色無定形粉末，分子式為C23H30N2O4，熔點102～106℃，沸點230～240℃，旋光度[ɑ]D+39°（氯仿），可溶于乙醇、氯仿和醋酸，對離體組織有抑制作用，還具有避部麻醉作用。人體內帽柱木堿的代謝是通過側鏈酯的水解、甲氧基的去甲基化、氧化和/或還原轉化以及葡萄糖醛酸和硫酸鹽偶聯的形成來實現的。這種生物堿的結構和致幻劑結構相似，但無致幻劑的活性，常用來阻止或緩解阿片類藥物依賴患者的戒斷癥狀，或被用于降低對阿片類藥物的依賴[3-6]。除此之外，由于卡痛葉的延緩戒斷綜合征作用，其也有一定的被濫用為毒品的風險。目前，帽柱木堿和7-羥基帽柱木堿已被多個國家列為受管制物質，因此，卡痛檢測試劑卡的研制開發具有重要的現實意義和市場需求。

毒品及毒品犯罪作為我國嚴厲打擊的對象，一直以來，深受國家重視，而毒品快速檢測方法的開發對于毒品打擊有至關重要的作用，尤其是新型毒品的檢測方法的開發，對于識別判定毒品流入，加強市場管控有重要意義[7]。

毒品檢測方法多樣，其中免疫層析技術的引入，對現場毒品檢測方法的發展有重要作用，運用免疫法制造的各種免疫試劑盒等能夠實現產品大規模商品化生產，且制作成本較低，操作簡便快速，便于實現毒品的現場初篩檢測[8]。

本研究采用膠體金免疫層析技術，運用Plackett-Burman試驗和Box-Behnken[9]試驗的方法，以卡痛試劑卡陰性質控結果為考察指標，對卡痛試劑卡玻纖體系進行優化，得到最優卡痛檢測試劑卡玻纖方案。

1.材料與方法

1.1?實驗材料和儀器

1.1.1?實驗材料

帽柱木堿：購于Cerilliant;檸檬酸三鈉、K2CO3為常規分析純試劑;牛血清蛋白帽柱木堿偶聯物：杭州傲銳生物醫藥科技有限公司;鼠抗帽柱木堿單克隆抗體：杭州傲銳生物醫藥科技有限公司;羊抗兔IgG：杭州傲銳生物醫藥科技有限公司;兔IgG：杭州傲銳生物醫藥科技有限公司;氯金酸、牛血清白蛋白（Bovine?albumin，BSA）玻璃纖維、硝酸纖維素膜（NC膜）、樣品吸收墊、PVC底板、吸水墊等均為杭州奧泰生物技術股份有限公司提供;

1.1.2?實驗儀器

三維XYZ3000?點膜儀，由Bio-Dot?公司提供;3H16R1高速冷凍離心機，由長沙湘智離心機儀器有限公司提供;AutoKun?HG5510金標機，由杭州峰航科技提供;電熱鼓風干燥箱，由上海一恒科學儀器有限公司提供;全自動切條機：上海金標生物科技有限公司;85-2?型恒溫磁力攪拌器：上海志威電器有限公司;奧瑞德分析儀，杭州奧泰生物技術股份有限公司。

1.2?實驗方法

1.2.1?卡痛試劑卡的檢測

取3滴（約40?L）陰性質控或者陽性質控加入到試劑卡加樣窗口中，5min后采用奧瑞德分析儀讀取試劑卡的線條強度。

1.2.2?Plackett-Burman實驗設計

對緩沖劑的添加量，PH，烘制溫度，烘制時間和活性劑的添加量等5個因素進行考察，每個因素取低水平和高水平，另設一個空項列，以卡痛試劑卡陰性質控響應值為考察指標，設計N=12的Plackett-Burman實驗。

1.2.3?Box-Behnken實驗設計

在Plackett-Burman實驗結果的基礎上，以卡痛陰性質控響應值作為考察指標，選取因素A（Na2HPO4添加量），因素B（pH值），因素C（Chemal?LA-9添加量）等三個因素為自變量，根據Box-Behnken設計原理，做三因素三水平的響應面試驗。

2?結果與分析

2.1?卡痛試劑卡質控檢測結果的判讀

采用奧瑞德分析儀對不同質控色卡進行讀數，質控色卡的線條強度越弱，分析儀上響應值越弱，其關系曲線如圖1所示，質控色卡的線條強度與分析儀響應值曲線有較好的擬合度（R2=0.9917）。

2.2Plackett-Burman實驗設計及結果

緩沖劑的添加量，pH，烘制溫度，烘制時間和活性劑的添加量等5個因素進行考察，每個因素取低水平和高水平，另設一個空項列，以卡痛試劑卡陰性質控響應值為考察指標，設計N=12的Plackett-Burman實驗。其中A為Na2HPO4添加量，B為pH值，C為玻纖烘制溫度，D為玻纖烘制時間，E為Chemal?LA-9添加量。

利用MINITAB15對Plackett-Burman的實驗數據進行統計分析，結果如表2所示，其標準偏差為2.11021，R2為93.68%，調整后R2為86.09%。其中兩個因素Na2HPO4添加量和Chemal?LA-9添加量對結果的有顯著影響（P<0.05），pH值對結果有極顯著影響（P<0.01），此三個因素均可作為進一步優化因素。其他因素對結果影響不大，對影響效果不進行分析。

2.3Box-Behnken實驗設計及結果

根據Plackett-Burman實驗結果，以卡痛陰性質控響應值作為考察指標，選取因素A（Na2HPO4添加量），因素B（pH值），因素C（Chemal?LA-9添加量）三個因素為自變量，根據Box-Behnken設計原理，采用三因素三水平的響應面方法進行分析，每個自變量的低、中、高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼。Box-Behnken設計及結果見表3。

實驗數據采用MINITAB15軟件進行統計分析，得到自變量相對于結果的回歸方程，標準差為1.19245，R2為97.00%，R2Adj為91.60%，表明模型的相關性和解釋度都很好。方差分析的結果表4表明，模型P值小于0.01（模型極顯著），失擬項P值為0.138不顯著，說明方程不失擬，所選模型合適。因此該Box-Behnken試驗設計可靠，模型可以應用于卡痛試劑卡玻纖體系優化的理論預測。在該模型中，回歸系數的顯著性檢驗顯示一次項A，一次項B和平方項B2達到顯著水平;平方項A2的影響達到極顯著水平;3個因素對卡痛試劑卡結果影響大小的排序為：B>A>C。各因素交互作用對卡痛試劑卡陰性質控結果影響的響應面如圖2所示。

2.4卡痛試劑卡最佳玻纖工藝驗證

運用MINITAB15響應優化器，可以得出，最優的玻纖方案是，Na2HPO4添加量為0.05M，Chemal?LA-9添加量為8.74g/L，PH值為7.0時，理論方案達到最優為485.51mV。在此條件下進行3次平行驗證實驗，取平均值，實際測卡痛試劑卡陰性質控響應值為為480.44mV，實際值與預測值相對誤差為1.04%，說明采用Box-Behnken試驗優化得到的工藝參數準確可靠，有實際應用價值。

3結論

卡痛是一種新型阿片替代物類毒品，具有一定的成癮性。本研究先從緩沖劑和活化劑類型的選擇對卡痛試劑卡陰性質控結果影響方面考察，聯和采用Plackett-Burman試驗和Box-Behnken試驗的方法，建立了卡痛試劑卡玻纖體系的多項式模型，經顯著性檢驗分析和響應面分析，其最佳工藝參數為Na2HPO4添加量為0.05M，Chemal?LA-9添加量為8.74g/L，pH7.0，獲得卡痛試劑卡陰性質控結果的理論值為485.51mV。經驗證實際值為480.44mV，證明該模型準確可靠。該研究為今后對此卡痛試劑卡開發研究奠定了基礎，同時也為卡痛試劑卡的工業化制備和應用提供理論參考。

參考文獻

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