一種國產齲活性培養基與標準培養基一致性及有效性的實驗檢測

VIVIEN FENG，張 羽，曹桂芝，吳日玥，陳 曦

近年來，兒童患齲明顯呈上升態勢，第四次全國口腔流行病學調查顯示，全國3歲兒童的齲患率為50.8%，4歲兒童為63.6%，到了5歲則高達71.9%[1]。通過齲病風險預測，早期發現并采取預防措施是控制齲病的關鍵[2]。

齲病活性檢測(caries activity tests, CAT)是早期檢測齲病風險的實驗室方法，目前應用較多的方法有檢測變形鏈球菌數量、觀察乳桿菌數量、觀察菌群分解蔗糖程度、測試唾液緩沖能力等[3]。其中Cariostat齲活躍性試驗法是通過培養細菌，觀察培養基顏色變化從而判定致齲菌群生長及分解蔗糖的程度，預測機體對齲病的易感性。該方法對兒童群體操作相對簡單，無特殊實驗室要求，結果判定容易，成為應用于兒童齲易感性篩查中較為常用的判定齲活性的方法[4]。然而，由于進口齲活性檢測產品成本較高且獲得渠道有限，尋找簡便易得的試劑盒，評估兒童患齲風險具有重要意義。

基于此，本研究的目的是通過比較一種國產培養基和日本標準培養基兩種齲活性測試劑在檢測細菌產酸方面的一致性、敏感性和準確性，借此評估國產齲活性培養基的有效性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

國產培養基：煜芽增菌培養基(滁洲瑞谷生物技術有限公司，安徽省滁洲市，中國，以下簡稱國產培養基)；日本Cariostat培養基(Dentsply Sirona K.K.,Tokyo, 日本，以下簡稱標準培養基)；腦心浸出液肉湯(Bacto Laboratories Pty Ltd,Liverpool, 英國)；胰蛋白胨大豆瓊脂(青島高科技工業園海博生物技術有限公司，青島，中國)；革蘭染色試劑(珠海貝索生物技術有限公司，珠海，中國)；氯化鈉粉劑(青島高科技工業園海博生物技術有限公司，青島，中國)；0.9%氯化鈉(國藥集團化學試劑有限公司，上海，中國)；所采用的測試菌種為：變異鏈球菌UA159(Streptococcusmutans)；血鏈球菌ATCC10556(Streptococcussanguinis)；唾液鏈球菌ATCC25975(Streptococcussalivarius)；遠緣鏈球菌ATCC6715(Streptococcussobrinus)；嗜酸乳桿菌ATCC4356(Lactobacillusacidophilus)；牙齦卟啉單胞菌ATCC33277(Porphyromonasgingivalis)；具核梭桿菌 ATCC25586(Fusobacteriumnucleatum)；黏性放線菌ATCC 27044(Actinomycesviscosus)。血鏈球菌及黏性放線菌標準菌株來源于上海哈靈生物科技有限公司，其余標準菌株均由上海交通大學附屬第九人民醫院口腔微生物實驗室提供。

1.2 實驗設計與方法

1.2.1 菌液的制備 上述8種細菌，接種于瓊脂/血培養基，37 ℃厭氧復蘇48 h，收集菌落做生化鑒定，確定為純培養后分別由腦心浸液(Brian-heart-infusion, BHI)中培養24～48 h增菌，革蘭染色后顯微鏡下觀察并攝片，確保菌株無污染后，離心收集細菌后由0.9%生理鹽水沖洗2次,將上述菌種分別置于紫外分光光度計540 nm處制備成紫外分光吸光度值在1.0±0.2的菌懸液。圖1示顯微鏡下的8種菌株。

1.2.2 實驗方法 菌懸液梯度稀釋，用0.9%生理鹽水(0.9%NS)將菌懸液按照不同比例進行稀釋為4組：未稀釋、1∶10、1∶100、1∶500。各濃度梯度的菌種重復4次。并設置0.9%生理鹽水為空白對照組。

將上述稀釋梯度及空白對照分別取100 μL加入至國產培養基及標準培養基中。37 ℃恒溫培養48 h。依據產品說明書，在同一光源條件下，3名經過培訓并且一致性良好的讀數員采用盲法讀數，即由試驗者打亂培養基順序后讀數。

讀數含義如下：0：陰性；1：較低患齲風險；2：中度患齲風險；3：高度患齲風險，其中0和1又記為0(低風險),2和3記為1(中高風險)。

1.3 統計學方法

使用SPSS 19.0統計軟件包進行國產與標準培養基讀數的卡方檢驗(計算Kappa值)，并計算準確率、敏感性、特異性，統計中顯著性檢驗水平設為0.05。

2 結 果

本次國產培養基與標準培養基讀數結果見表1。按照患齲的低風險和中高風險分別記為0和1，對讀數重新編碼，檢查者1、2、3的Kappa值分別為0.803、0.785和0.832(P<0.001)(表2)；3名檢查者匯總數據后Kappa值為0.807(P<0.001)(表3)。以標準培養基為準，國產培養基敏感性為94.7%，特異度為84.7%，準確率為90.1%。

表1 檢查者原始讀數匯總

表2 各檢查者齲風險讀數(重編碼)

表3 檢查者齲風險讀數匯總(重編碼)

3 討 論

齲病是一種在多因素影響下，以細菌為主的牙體硬組織發生慢性進行性破壞的一種疾病[5]。兒童齲病發病率高居兒童常發疾病的首位，根據我國第四次全國口腔健康流行病學調查報道顯示，全國3～5歲年齡組乳牙患齲率為62.5%[1]，對兒童齲齒的預防顯得尤為重要。

菌斑既是齲病的病因, 又是齲病發生的環境,其產酸能力大小是判斷牙菌斑致齲力的重要指標之一,牙菌斑內的產酸代謝活動是產生齲病損害的直接原因[1-2,5]。

如今，致齲微生物作為齲發生的預測指標已經得到了認可，在致齲微生物中，變形鏈球菌和乳桿菌與齲病發生和進展的關系已非常明確[6]。對早期釉質齲的研究發現, 齲活躍人群的牙菌斑中變形鏈球菌、乳桿菌等產酸、耐酸力強的細菌含量較不活躍人群明顯增高，其中變形鏈球菌的水平可以作為低齡兒童齲的預測指標[7-8]。通過多項對低齡兒童患齲的細菌學研究表明，患齲兒童菌斑中變形鏈球菌的檢出率及變形鏈球菌占總鏈球菌的百分比均明顯高于無齲兒童[9]。Cariostat是通過檢測菌斑產酸能力來評估齲易感性的方法之一，菌斑中產酸致齲菌在試劑培養基內經恒溫培養分解代謝蔗糖生成乳酸,使試劑中特定的pH 指示劑產生顯色反應,顯色變化能反映乳酸的生成量,由此推斷采樣標本中致齲菌的量及機體的齲病活躍性[4-5,10]。有研究顯示Cariostat值在嬰兒期已顯示出和低齡兒童齲的顯著相關性，對低齡兒童齲的發展起到早期預測作用[11-12]。以Cariostat為代表的齲易感性檢測操作簡便，結果準確且可多次重復，適宜應用于預測兒童患齲風險[13-14]。但由于進口檢測試劑的渠道和價格的限制，在臨床持續應用及群體篩查工作中并未普及。本次實驗選擇的國產培養基取樣方法亦簡便無損傷，與標準培養基的產品主要組成成分相似，均由胰蛋白胨、蔗糖、氯化鈉、溴甲酚等組成，所培養的細菌以胰蛋白為氮源、以蔗糖為碳源、以溴甲酚為酸性顯示劑，培養時產酸從而改變培養基的顏色[15-16]。

本實驗選擇的8種標準菌是口腔內的主要致病菌，除了常見的產酸、耐酸菌株如變形鏈球菌和嗜酸乳桿菌外，本次實驗也選用了具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌等牙周致病菌。選擇此類非產酸耐酸菌作為陰性對照，以驗證國產培養基對于其他非酸性產物無陽性反應。但本實驗只選用了8種標準菌株，而非混合菌斑，不能代表人體內菌斑的實際情況。今后應進一步檢測兩種培養基在檢測體內混合菌斑方面的一致性，以提供更多數據。

針對兩種培養基的實驗讀數，3名檢查者所得到的Kappa值介于0.78～0.83，總Kappa值為0.8以上，證明國產培養基對于判斷齲低危和中高危方面，是完全可靠的。但兩種培養基還存在一定差異，推測可能的原因是：國產培養基與標準培養基組分近似，但各成分濃度的細微差異使得兩種培養基培養出的致齲菌濃度仍存在一定差異。就本次實驗結果看，國產培養基敏感性高于標準培養基，即國產培養基診斷得分普遍高于標準培養基，可以更敏感地識別有齲易感性的兒童，但相較于敏感度，其特異性尚顯不足。今后仍需結合其他檢測方法，用于大規模人口的篩查。

目前，齲活性實驗主要用于流行病學調查中目標人群的篩查，要求所采用的試驗方法簡單、成本低廉。然而目前常用的進口齲活性檢測產品成本較高,并且產品獲得渠道受限,限制了國內相關研究的開展。此次實驗旨在通過實驗室的前期研究，檢驗國產培養基在檢測細菌產酸方面的效果，為進一步推廣使用國產培養基提供實驗室的依據和數據。本次實驗選擇的國產培養基可能是一種非常有希望的替代品，但其是否能夠準確預測齲易感性仍需進一步的針對人群的前瞻性研究。同時，科學準確評估患齲風險是兒童齲病預防中的重要一環。齲病為多因素致病疾病，國際常用齲風險評估體系都是多因素綜合的系統，包括美國兒童牙科學會(AAPD)研發的Caries-riskAssessmentTool，美國加尼福利亞牙科協會研發的CariesManagementbyRiskAssessment；美國牙科協會(ADA)研發的Caries-riskAssessmentSystem；瑞典研發的cariogram等[17-20]。但上述齲風險評估體系不適用于國人，且單一預測方法尚無法準確預測齲病易感性，因此后續研究包括：繼續尋求更多高準確度、高性價比、易獲取的實驗產品(如唾液流速相關產品、唾液緩沖能力檢測產品等)；建立健全適用于我國兒童的，綜合臨床檢查、病史、口腔細菌環境等多因素的齲病風險評估系統，更好地為我國人群的齲病預防服務。