透明質酸及其合成酶在炎癥牙髓組織中的表達

陳蔚婷，蔣備戰

透明質酸(hyaluronic acid, HA)作為糖胺聚糖家族成員，是細胞外基質的主要成分。它是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺的雙糖單位重復數千次組成的大分子酸性粘多糖，分子量可達到5×106ku。透明質酸由細胞膜上一組高度專一性的透明質酸合成酶(hyaluronic acid synthase, HAS)合成，并分泌到細胞外基質中。HAS有3種保守的同工酶，在哺乳動物中，分別為HAS1、HAS2、HAS3。HAS1和HAS2能夠合成高分子量透明質酸(2 000 ku)，而HAS3合成低分子量透明質酸(100～1 000 ku)[1]。透明質酸具有許多不同的生物學功能，能夠維持組織結構穩定、重塑組織、調節細胞形態變化、調節細胞信號傳導，細胞粘附及細胞的增殖分化等。研究證明透明質酸在多種生理和病理過程中作為一種重要的調節劑，特別在炎癥反應中具有重要的作用[2-3]。近年來，透明質酸在口腔疾病治療中的應用日益受到關注，特別是其在顳下頜關節炎[4]、牙周炎[5]、種植體周圍炎[6]等感染性炎癥疾病的治療中取得了較好的療效[7]。透明質酸還可以作為支架材料應用于組織工程以實現組織的再生[8-9]。Ferroni等運用外源性透明質酸支架復合人牙髓干細胞，在體外成功獲得牙髓樣組織[10]。然而機體內源性透明質酸及其合成酶與牙髓組織炎癥狀態的相關研究至今鮮有報道。因此，本研究旨在通過系統檢測炎癥牙髓組織中內源性透明質酸及其合成酶的表達，為研究其在牙髓組織炎癥調控過程中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣本的收集

本研究經同濟大學附屬口腔醫院倫理委員會批準，事先向患者告知，知情同意后進行。臨床收集患者因埋伏阻生而預防性拔除的健康下頜第三磨牙(n>5)，以及萌出后因齲壞導致牙髓炎而拔除的下頜第三磨牙(n>5)。

1.2 組織學處理及蘇木素-伊紅(HE)染色

在無菌操作臺內，使用高速渦輪機縱向磨開正常及炎癥狀態的第三磨牙，不傷及牙髓組織情況下取出正常及炎癥狀態的牙髓組織。PBS沖洗后用4%多聚甲醛(PFA)固定在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)中，室溫固定20 h，石蠟包埋。制作5 μm厚的組織學切片，60 ℃烤片過夜，4 ℃下保存備用。切片用于后續HE染色，免疫組織化學染色以及免疫熒光共染。將預備好的切片經脫蠟、二甲苯和乙醇梯度復水，常規HE染色、光鏡觀察組織學變化，確定牙髓組織正常及炎癥狀態。

1.3 免疫組織化學染色及免疫熒光染色實驗

本次實驗所有購買的抗體都有在線驗證數據，具體信息如下。一抗：兔多克隆抗-TNFα(1∶100, Immunoway, YT-4689, 美國)；羊多克隆抗-HA(1∶100, Abcam, ab-53842, 美國)；山羊多克隆抗-HAS1(1∶100, Santa Cruz, sc-23145, 美國)；兔多克隆抗-HAS2(1∶100, 博士德, ba3397, 中國)和山羊多克隆抗-HAS3(1∶100, Santa Cruz, sc-34204, 美國)。二抗：Alexa Fluor?488-驢抗兔IgG(1∶200, Life technology, 美國)；Alexa Fluor?546-驢抗山羊IgG(1∶200, Life technology, 美國)和donkey anti-goat IgG(1∶1 000, Abcam, ab-6884, 美國)。

免疫組化染色使用免疫組化試劑盒(邁新, KIT9707-兔, 中國)。組織切片常規脫蠟至水；PBS清洗后置于3% H2O2中10 min，滅活內源性過氧化物；37 ℃酶消化法孵育1 h進行抗原修復，PBS漂洗后5% BSA孵育30 min，再在4 ℃和一抗孵育過夜。陰性對照組的組織切片用PBS代替一抗孵育。PBS漂洗后二抗室溫孵育20 min，再次PBS漂洗后與鏈霉親和素標記的過氧化物酶室溫反應20 min，以3,3′-二氨基聯苯胺(DAB)為顯色劑，蘇木素復染，封片劑(YEASEN, 36307ES08, 上海)封片，立體顯微鏡(Carl Zeiss, Stemi508,德國)及數碼顯微鏡(Nikon Eclipse 80i, 日本)觀察。

免疫熒光檢測先將組織切片與熒光二抗在室溫下孵育1 h。使用DAPI(Sigma, D9542-10MG, 美國)進行細胞核染色，使用甘油封片，鏡檢拍照，熒光顯微鏡觀察((尼康 DS-Ri1-U3, 日本)；(尼康Intersilight C-HGF1, 日本))。

1.4 實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)

用Trizol試劑(Life Technologies, Carlsbad, CA, 美國)裂解牙髓組織，分離總RNA。提取的RNA用互補DNA合成試劑盒(Roche, Schlieren, 瑞士)進行逆轉錄，用FastStart Essential DNA Green Master(Roche, Schlieren, 瑞士)進行反應，qRT-PCR法反應檢測IL-6、IL-8、TNFα、HAS1、HAS2 及 HAS3的mRNA的表達。采用Roche.LC96分析軟件分析PCR過程，每個樣本設置3個復孔，以CT值代表熒光qRT-PCR的結果，ΔCT = CT目的基因-CT內參基因，ΔΔCT = ΔCT實驗組-ΔCT對照組。根據公式2-ΔΔCT計算出實驗組中目的基因的相對表達量，根據溶解曲線判斷擴增產物的特異性。使用SPSS 20.0單因素ANOVA進行統計學分析，Graphpad 7.0進行繪圖。引物序列見表1。

表1 HAS1、HAS2、HAS3、IL-6、IL-8、TNFα引物序列

2 結 果

2.1 HE染色

HE染色結果顯示，與正常牙髓組織相比，炎癥牙髓組織中出現組織炎癥改變，如炎性細胞浸潤、膠原纖維增厚、空泡變性、成牙本質細胞層排列紊亂甚至組織壞死(圖1a,d)。

正常牙髓(a, b, c, g, h, i)；炎癥牙髓(d, e, f, j, k, l)；HE(a, d)；TNFα(b, e)；HA(c, f)；HAS1(g, j)；HAS2(h, k)；HAS3(i, l)

2.2 免疫組織化學染色

常規免疫組化染色結果提示，在正常牙髓組織中幾乎無法檢測到TNFα的表達，而在炎癥牙髓組織中TNFα的表達明顯強于正常牙髓組織。正常牙髓組織中可檢測到HA以及HAS1、HAS2、HAS3的表達。在炎癥牙髓組織中的HA、HAS2以及HAS3的表達比正常牙髓組織的表達明顯(圖1b, c, e, f, h, i, k, l)。HAS1在兩種牙髓組織中的表達均較弱，無明顯差異(圖1g, j)。

免疫熒光染色結果提示，在炎癥牙髓組織中TNFα、HA的表達均分別強于它們在正常牙髓組織中的表達，且TNFα和HA之間可見熒光共染色，即在TNFα表達增強的區域，透明質酸表達亦相應增強(圖2a～h)，而HAS1在健康和炎癥牙髓組織中的表達均較弱，其與TNFα在炎性牙髓組織中的表達不一致(圖2i～p)；在TNFα表達增強的炎癥牙髓組織區域，HAS2(圖3a～h)和HAS3(圖3i～p)表達也很明顯，且HAS2的熒光染色信號比HAS3更強。

正常牙髓組織(a, b, c, d, i, j, k, l)；炎癥牙髓組織(e, f, g, h, m, n, o, p)；DAPI(a, e, i, m)；TNFα(b, f, j, n)；HA(c, g)；HAS1(k, o)；TNFα/HA雙標共染(d, h)；TNFα/HAS1雙標共染(l, p)

正常牙髓組織(a, b, c, d, i, j, k, l)；炎癥牙髓組織(e, f, g, h, m, n, o, p)；DAPI(a, e, i, m)；TNFα(b, f, j, n)；HAS2(c, g)；HAS3(k, o)；TNFα/HAS2雙標共染(d, h)；TNFα/HAS3雙標共染(l, p)

2.3 實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)

qRT-PCR結果和組織學染色結果一致，顯示在炎癥牙髓組織樣本中,IL-6、IL-8、TNFα(PIL-6=0.000 017；PIL-8=0.000 016;PTNFα=0.000 589)的mRNA表達明顯較正常牙髓組織有明顯的增加(圖4A)；與此同時，HAS2、HAS3(PHAS2=0.003 373;PHAS3=0.000 123)的mRNA表達量亦較正常牙髓有明顯的增加。HAS1的表達量在炎癥牙髓組織中較正常牙髓組織中稍有增加(P=0.025 232)(圖4B)。P<0.05時認為差異有統計學意義。

A：正常及炎癥牙髓組織中IL-6、IL-8、TNFα的mRNA的表達；B：正常及炎癥牙髓組織中HAS1、HAS2、HAS3的mRNA表達

3 討 論

牙髓是來源于外胚間充質的疏松結締組織，位于由牙本質所形成的髓腔內，借狹窄的根尖孔與根尖周組織相連，由于缺乏足夠的血液循環，因而極其脆弱。齲齒、牙外傷等都可引起牙髓組織感染性炎癥，最終導致牙髓壞死甚至根尖周病變。牙髓組織在感染狀態下引起炎癥反應，釋放各種炎癥因子。炎癥反應對感染狀態下的牙髓組織而言是一把雙刃劍，輕微的炎癥可以刺激牙髓組織中的牙髓干細胞遷移到受傷部位，隨后分化為成牙本質細胞并參與形成牙髓-牙本質復合體并產生修復性牙本質。嚴重的炎癥引起不可逆的牙髓炎導致牙髓組織壞死[11]。透明質酸是牙髓組織中細胞外基質的重要成分，在維持細胞穩態、血管與細胞間的物質傳遞中發揮重要的功能，但有關透明質酸在牙髓組織炎癥狀態的表達以及作用至今仍不清楚。

本次實驗通過HE染色觀察到炎癥牙髓組織樣本組織學的改變，通過免疫組織化學實驗檢測到其中TNFα的免疫染色陽性表達結果、采用qRT-PCR 進一步驗證了炎癥因子IL-6、IL-8、TNFα在炎癥牙髓組織樣本中表達升高，以上結果均證明了所取牙髓組織的炎癥狀態，可用于后續的研究。研究結果同時表明在炎癥牙髓組織中，HA、HAS2及HAS3的免疫染色強度較在正常牙髓組織中有明顯增強，相關合成酶的mRNA表達亦較正常牙髓組織中明顯升高，這些結果都進一步表明透明質酸可能參與牙髓組織炎癥狀態的調控。

透明質酸分子是一個長的線性聚合物結構，分子量范圍4.0×103～5.0×106ku。以往研究表明，透明質酸對組織炎癥狀態的調控和其分子量大小相關。大分子量透明質酸(HMWHA)由HAS1、HAS2合成，具有抗炎活性，而低分子量的透明質酸(LMWHA)則由HAS3合成，可以促進炎癥的進程[12]。研究表明，LMWHA能夠啟動NF-κB信號傳導進而誘導炎癥，從而在各種類型的細胞中產生如包括IL-6、IL-8及TNFα在內的促炎細胞因子和趨化因子[13]。在人牙髓細胞中的研究證實，HMWHA有利于損傷后炎癥狀態下的組織修復[14]。另一方面，炎癥介質可以通過調節透明質酸合成酶的表達，調節所合成的透明質酸的分子大小，參與炎癥反應[15]。本次實驗免疫熒光染色結果提示炎癥牙髓組織中TNFα表達增強的區域HAS2、HAS3的表達均明顯升高，并且HAS2的熒光染色信號明顯比HAS3更強。HAS2和HAS3之間的表達差異提示我們不同分子量大小的透明質酸都可能參與了牙髓組織炎癥狀態的調節；并且，HAS2及其合成的具有抗炎活性的HMWHA較HAS3及其合成具有促炎活性的LMWHA而言，在牙髓組織的炎癥調控中可能更加占據優勢。免疫染色結果提示HAS1在炎癥牙髓組織中的表達和正常牙髓組織中的表達均較弱，且兩者之間的差異并不明顯。以往的文獻表明HAS1主要在生長發育階段發揮重要作用[16]，這和我們早前的實驗結果保持一致[17]。因此推測在發育成熟的恒牙牙髓組織中，HAS1對牙髓炎癥狀態的調控作用弱于HAS2及HAS3。

綜上所述，本次研究采用免疫染色以及qRT-PCR檢測的方法，在炎癥牙髓組織中檢測到了HA、HAS2及HAS3的高表達，結果提示牙髓組織中內源性透明質酸及其合成酶HAS2、HAS3都可能參與了對牙髓組織炎癥感染狀態的調控。然而透明質酸調控牙髓組織炎癥狀態的具體作用機制以及HAS2、HAS3在牙髓組織炎癥狀態的調控中發揮的具體作用仍有待進一步探討研究。