紅外光譜在食藥用菌化妝品發酵原料檢測中的應用初探

馬玉涵 趙巖 孫玉軍 李坤

摘 ?要：相比于傳統的基于乳化技術和萃取技術為基礎的化妝品生產方法，更加環保天然的食藥用菌發酵化妝品受到越來越廣泛的關注。然而，發酵過程復雜多變，各種底物、產物、發酵菌種混合其中，構成了一個隨時變化的大數據系統。如何將這些數據快速、高通量采集、整合、分析，并對發酵過程進行快速反饋和終點預判，是發酵過程監控的關鍵。紅外光譜分析技術具有全程、在線、無損、高效等眾多優點，以大數據處理為基礎，利用化學計量學方法，結合神經網絡算法、PLS、iPLS等算法和機器學習方法，構建定性與定量模型，可以對發酵產物、發酵過程限制因子、發酵品質予以預判，對發酵過程諸元信息整合，構建發酵終點判定標準，以實現對發酵化妝品原料生產信息的采集監測、集成、分析、解析、策略設計和實時控制。

關鍵詞：紅外光譜 ?化妝品 ?發酵 ?無損檢測

中圖分類號：Q632 ? 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2020）06（c）-0057-05

Abstract： Compared with traditional cosmetic production methods based on emulsification and extraction technology， fermentation engineering technology have gained more extensive attention. However， the fermentation process is complex and changeable， among which various substrates， products and fermentation strains are mixed， which constitute a large data system that changes all the time. How to collect， integrate， analyze these data quickly， feed back in real time， and prejudge the reaction endpoints of fermentation process are the keys for the monitoring of fermentation process. Infrared spectrum analysis technology has many advantages in fermentation process， including on-line， non-destructive， high efficiency and full-range control. Based on mega data processing， using chemometrics method， combining neural network algorithm， PLS， iPLS and machine learning method， the qualitative and quantitative model can be constructed to realize the monitoring， integration， data analytics， understanding， strategy design and control in the raw material production for fermented cosmetics.

Key Words： ?Infrared Spectroscopy; Cosmetic; Fermentation; Nondestructive Testing

1 ?化妝品發展的發展歷程

化妝品，是指以涂擦、噴灑或者其他類似的方法，散布于人體表面任何部位（皮膚、毛發、指甲、口唇等），以達到清潔、消除不良氣味、護膚、美容和修飾目的的日用化學工業產品[1]、其發展大致可以分成以下階段。

第一代是使用天然的動植物油脂對皮膚做單純的物理防護。即直接使用動植物，或礦物來源的不經過化學處理的各種油脂。這一過程可以追溯到古人類時期[2]，在埃及、古羅馬等也有廣泛應用[3，4]。

第二代是以油和水乳化技術為基礎的化妝品。其代表是表面活性劑的大量使用[5]，也包括香精、防腐劑等化學試劑的合成和使用[6]。這一過程可以追溯到古巴比倫時期[7]，15世紀，這一類型的化妝品在歐洲半工業化生產[8]，18世紀后期，歐美的大工業化的生產開始[9]。世界最大的化妝品巨頭之一，聯合利華公司，就在這一過程中誕生的[10]。

第三代是添加各類動植物萃取精華的化妝品。化妝品中的化學成分給身體帶來的副用作引起人們的關注，于是從20世紀70年代以后，化妝品界又掀起了回歸自然的熱潮，開始提倡用天然油代替礦物油，井從皂角、果酸、木瓜等天然植物中提取原料。將提取到的膠原蛋白、深海魚油、超氧化物岐化酶（SOD）、維生素等加入到化妝品中，促進了化妝品的跨越式發展[6]。歐萊雅、雅詩蘭黛、資生堂等旗下大量“天然”化妝品系列是此類代表。

第四代是仿生化妝品。即采用生物技術制造與人體自身結構相仿并具有高親和力的生物精華物質并復配到化妝品中。這一變化主要發生在21世紀。例如玻尿酸[11]、表皮生長因子[12]、神經酰胺[13]等生物活性物質在化妝品中的使用。例如，在歐萊雅的化妝品中，其中CeraVe系列完全以神經酰胺作為主要活性成分，其CeraVe的品牌就來自于神經酰胺（Ceramide）這一名稱。

然而，在化妝品中直接加入生物活性物質，甚至激素，對人體也存在潛在的危害，因此受到質疑。我國2019年1月禁止在化妝品中添加含有表皮生長因子成分。與此同時，生物發酵技術用于中草藥化妝品的開發，因其多方面的功效，展現出廣闊的應用前景[1]。

2 ?中藥-食藥用菌雙向發酵技術在化妝品原料制備中的優勢

發酵類化妝品的開發始于20世紀70年代，日本科學家發現清酒釀造工人雖然年邁，但他們的雙手卻柔嫩富有光澤，他們從清酒發酵液中分離得到一種酵母pitera，以此發酵獲得化妝品原料，從而開發出了具有世界影響的品牌SK-Ⅱ[14]。后續的，雅詩蘭黛、歐萊雅等化妝品巨頭也陸續開發了雅詩蘭黛小棕瓶、海藍之謎系列等[15]。上述發酵均以酵母菌作為出發菌株，通過對培養基中糖類物質的發酵獲得發酵產物，其中的藥理活性成分較少。藥用化妝品市場發展迅速，前景廣闊[16，17]。如果能將發酵技術與藥用藥用成分結合起來，則會兼具二者優點，發揮乘數效應。“雙向發酵”技術在化妝品原料生產中的使用成為必然。所謂“雙向發酵”是指采用具有一定活性成分的中藥材或藥渣作為藥性基質來代替傳統的營養基質，并把經過優選的菌種加入其中進行微生物轉化，它們構成的發酵組合稱作藥用菌質。其雙向性體現在藥性基質在提供真菌所需營養的同時，還受到真菌中酶的影響而改變自身的組織、成分，產生新的性味功能[18]。

雙向發酵技術在中藥化妝品原料制備中具有多重優勢：（1）提高中藥中活性成分的利用效率;（2）降低中藥原料的不良反應;（3）成分更加天然，具有更好的膚感;（4）具有一定的抗菌作用。

3 ?基于機器學習的諸元信息采集反饋系統是發酵過程監督的關鍵

相比于加入各種化學制劑的配方化妝品生產方式，發酵式的化妝品生產方式調控更為復雜。其中發酵體系中的參數諸元（初始底物種類濃度、培養基、菌種，發酵過程中的供氧量、pH等）時刻發生了復雜的生物和化學變化[19]。傳統的發酵控制往往依賴于工人的經驗，利用取樣孔取樣結果，通過對個別參數的判斷實施對發酵體系的監督。這一做法的缺陷是顯而易見的：無法對發酵體系進行實時監控，對每一種產物的檢測都需要單獨的檢測方法，無法實現信息的整合和高通量分析，在對多種產物進行分析和發酵體系優化控制時具有明顯的局限性。這在大數據和機器學習尚未普及的時代是正常的，但顯然無法適應發酵產業的快速發展。

發酵過程的眾多參數構成了一個實時變化的大數據集合。如何將這些數據高效、無損、實時、在線的采集、整合、分析，并對發酵過程進行實時反饋和終點預判，是發酵過程監督的主要環節。而其中的發酵諸元數據實時、高通量、無損、在線采集，是后續數據分析整合的基礎，是實現發酵過程智能監督的關鍵。

4 ?紅外光譜技術在生物檢測中的優勢

光是人類對世界的最初方式，利用光對物質的認識有眾多優點，如無損、快速。但常見的可見光只是電磁波中很小的一部分。1800年，威廉·赫歇爾發現了紅外線（紅外輻射），揭開了人類對可見光范圍外電磁波認識的序幕[20]。

分子振動的能量與紅外射線的光量子能量正好對應，因此當分子的振動狀態改變時，就可以發射紅外光譜，也可以因紅外輻射激發分子而振動而產生紅外吸收光譜[21]。紅外光譜可分為3個區段，分別為近紅外（13330cm-1到4000cm-1）、中紅外（4000cm-1到400cm-1）和遠紅外（400cm-1到10cm-1）譜段。化合物的基頻和合頻信號較強，而它們一般介于中紅外和近紅外范圍內，是紅外光譜常用的區段[22]。紅外光譜可以探測到物質分子的基團和鍵的振動，可以感受到物質中舊鍵的斷裂和新鍵的生成，從而對化學分子的變化過程加以分析[23-25]。在生物學領域，除了常見的紅外熱成像以外，紅外光譜也有廣泛的應用：例如，利用原子力顯微鏡結合紅外光譜，可以研究高粱表皮的內外表面的蠟聚合體結晶度和化學官能團的表面分布[26];將紅外光譜分析技術與蛋白質組學方法結合，可以對膀胱癌的腫瘤標志物加以研究，判斷膀胱癌的潛在發生可能[27];將紅外光譜、拉曼光譜和掃描電鏡研究相結合，可對皮膚癌發生過程中的分子糖基化過程予以識別[28];利用功能近紅外光譜的成像技術，可以用來對自閉癥患者大腦信息傳遞過程進行研究，有助于實現神經發育過程障礙的早期判斷[29]等。

與其他檢測方法相比，紅外光譜具有多方面的優點：（1）可以對體系中的多種物質同時進行檢測，具有高通量的特點和多信息整合性[30，31];（2）根據體系中某一組分的特征性峰位，對特定物質進行指紋鑒定[32，33];（3）不同于傳統的化學測量方法，紅外光譜檢測無需對樣品進行處理，可以實現原位（in-situ）無干擾和無損檢測，這對需要維持原始狀態的檢測體系非常重要[34，35];（4）紅外光譜檢測速度快，無論中紅外還是近紅外光譜，一個樣品的64次掃描都在1min以內，適合于變化的過程的實時檢測[36，37];（5）可實現定性判斷和定量分析的統一[38，39]。

這些特點對于生物體系這一復雜的系統尤為重要：生物系統作為開放復雜的實時變化體系，如何從離體的ex-situ到in-situ，一直是研究過程的難題[39]。傳統的化學分析方法對離體的靜止分析到活體的動態過程監控是生物體系研究的必然趨勢，而光譜學的分析方法是可以勝任這一工作的有力武器[40]。

5 ?紅外光譜在線檢測是發酵體系諸元信息采集整合的基礎

活體生物如此，微生物發酵體系也會如此。在這一過程中，底物、產物、菌種、培養基混合在一起，pH值、溫度、溶氧量隨時變化，而這些有專門的探頭可以檢測[41];但底物、產物、多種培養基組分如何分析？是否每種組分都需要有專門的檢測器？此時，紅外光譜的優勢彰顯無遺[42]。

（1）利用紅外光譜可以對發酵產物進行定性和定量分析。

Ma等（2018）利用搖瓶發酵，可以同時將靈芝發酵過程中最關鍵的藥用成分——靈芝多糖和靈芝三萜鑒定出來，并對其進行了非在線的定量分析，構建了良好的搖瓶發酵體系的靈芝多糖和靈芝三萜的定性與定量分析模型[38]。趙巖等（2016）構建了酸奶發酵過程中的蛋白質、脂肪、碳水化合物等的定量分析模型這些結果表明，利用紅外光譜（中紅外和近紅外光譜）在非在線條件下可以對發酵體系中的目標產物進行有效的定性與定量分析，其檢測結果與化學測定結果一致[43]。

（2）利用紅外光譜可以對培養基中的發酵限制性因素予以排除。

Vann（2017）利用30L發酵罐對大腸桿菌進行批量發酵，以培養生產綠色熒光蛋白的研究發現，利用近紅外光譜，可以發現發酵培養中的限制性因素，并通過對發酵體系中補充維生素B組達到優化發酵體系的目的[42]。

（3）紅外光譜信息可以對發酵體系進行質量控制。

Cervera（2009）的研究表明，利用近紅外光譜可以對發酵過程進行質量控制，提供發酵過程中底物、生物量、產物和代謝物濃度的在線信息，將近紅外光譜和電子鼻相結合，可以有效地發現發酵過程中的污染現象[19]。此前該課題組在小規模發酵培養中，也發現了體系中的雜菌存在會造成紅外光譜的微小變化，并可以利用主成分分析予以識別。

（4）紅外光譜可以對發酵體系諸元信息加以整合，實現發酵體系的優化。

紅外光譜分析是對體系中的各種成分的光譜信息進行綜合判斷，是對體系整體進行分析，從而克服了傳統分析方法中各種檢測在時間和空間上的分隔和限制，避免了單獨項目檢測的時間差，避免了顧此失彼，有利于對多種信息進行優化整合。發酵過程中，當光譜信息滿足特定條件時，即達到了發酵反應終點。從而可以根據需要對某一產物或者多種產物的發酵生產進行反饋監控，利于發酵體系的優化。Vann（2017）的研究中，將近紅外光譜作為發酵體系的檢測器和效應器，是信息流的核心節點，在多種信息整合、分析過程中具有關鍵作用[42]。

6 ?基于機器學習的紅外光譜大數據解析和反饋可以實現對發酵全程監督

不同于中紅外光譜中各峰位代表明確的化學分子基團振動，近紅外光譜作為分子基團振動的倍頻和合頻，其化學信息往往難以解讀。因此，在眾多實驗技術中，近紅外光譜也成為最早一批將機器學習方法引入數據解析的領域之一。不同于當今對人工智能研究的火熱，早在20世紀80年代，就有了利用人工智能對紅外光譜信息解析的報道[44]，人們很早就將神經網絡算法、偏最小二乘法等方法用于訓練集和預測集的定量模型構建;用主成分分析、聚類分析等方式提取數據信息，用類比較的軟獨立建模（SIMCA）等方法對樣品集予以分類鑒定等[42，45]。

然而，受到計算能力的限制，早期的機器學習僅能對離線的部分光譜數據進行非在線解析[44]。隨著大數據、云計算和人工智能技術的廣泛應用，對發酵過程等大數據的多元信息解析成為可能，并為反饋控制和發酵終點預判奠定了基礎[45]。

為此，Vann（2017）等提出，構建基于近紅外光譜的信息采集監測、集成、分析、解析、策略設計和控制（Monitoring， Integration， Data Analytics， Understanding， Strategy Design and Control，MIDUS）體系，可以實現對發酵的全程高通量和高效監控，在發酵化妝品原料生產控制中具有廣闊的應用前景[42]。

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