知母皂苷AIII促進曲美替尼對肺癌A549細胞抑制活性的研究

肖 毅 朱欣婷 徐 衛 劉 云 李三華*

1. 遵義醫科大學醫學與生物學研究中心，貴州 遵義 563099；2. 貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治重點實驗室，貴州 遵義 563099；3. 遵義醫科大學基礎醫學院，貴州 遵義 563099；4. 遵義醫科大學藥學院，貴州 遵義 563099

由于環境污染、吸煙、肺部感染等誘發肺部腫瘤因素的增加，肺癌已成為全世界發病率和致死率均位居前列的惡性腫瘤[1]。目前，以藥物為主的化療仍然是肺癌治療的重要手段，但使用單一化療藥物治療惡性腫瘤具有較多局限性，比如藥物使用劑量大而導致毒副作用大，治療過程種產生耐藥而降低治療效果等。藥物聯用具有能夠實現藥物間的協同效用提高治療效果和降低藥物使用劑量降低毒副作用等優點，藥物聯用治療腫瘤已逐漸成為研究者和臨床醫生的關注重點之一。

來自于動物、植物和微生物的天然產物具有資源豐富、結構多樣和作用靶點多等優點，是抗腫瘤藥物的主要來源。皂苷是一類主要來源于植物的天然產物，是苷元為三萜或甾烷類化合物的一類糖苷物質。許多中藥如知母、柴胡、人參等中均含有皂苷類物質，具有抗腫瘤、抗菌、調節免疫、心血管保護和降血糖等多種藥理作用[2-4]。以皂苷類化合物為底物，通過生物轉化還可獲得結構新穎、活性優良、毒副作用小的皂苷轉化物，皂苷類化合物是先導化合物和新藥發現的重要來源[5]。知母是我國的傳統中藥，含有豐富的皂苷類活性物質；知母皂苷AⅢ(Timosaponin AⅢ)是知母中一種含量較為豐富的皂苷物質，是以菝葜皂苷元為母核，由菝葜皂苷元C-22 位的羥基脫氫后與兩個果糖和一個葡萄糖縮合而成的多糖苷，有抗腫瘤、抗抑郁、改善記憶與降血壓等多種藥理作用[2]，具有開發為臨床藥物的前景。本研究發現知母皂苷AⅢ低使用劑量對肺癌A549細胞的抑制作用較微弱時卻可以提高腫瘤靶向治療藥物曲美替尼(Trametinib)對細胞的抑制效應，研究結果對挖掘中藥知母及其活性物質在腫瘤臨床治療中的應用具有參考意義。

圖1 知母皂苷AⅢ的化學結構式

1 材料與方法

1.1 材料 知母皂苷AIII(Target Mol公司)，曲美替尼(百靈威科技有限公司)；A549細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司)；RPMI1640培養基(Hyclone公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；CCK8試劑盒與細胞周期檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司)。

1.2 儀器 FC酶標儀(Thermo)；C6流式細胞儀(BD)；IX73顯微鏡(Olympus)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 A549細胞用RPMI1640培養基(含10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL)于37 ℃、5%CO2和100%濕度環境中常規培養。

1.3.2 細胞生長檢測 A549細胞以5×103個/孔的密度接種到96孔培養板中培養，細胞分為4組，每組6個重復孔；24 h后分別加入體積分數為2.5‰的DMSO(對照)、7.5 μM的知母皂苷AIII、5 μM的曲美替尼、7.5 μM的知母皂苷AIII+5 μM的曲美替尼；于加藥后的24 h、48 h和72 h加入CCK8試劑，酶標儀測定520 nm光波吸光度值并計算細胞活率。細胞活率(%)=(OD對照組-OD藥物組)/ OD對照組×100%。

1.3.3 集落形成檢測 A549細胞以1×103個/孔的密度接種到6孔培養板中培養；24 h后細胞分為4組，分別加入體積分數為2.5‰的DMSO(對照)、7.5 μM的知母皂苷AIII、5 μM的曲美替尼、7.5 μM的知母皂苷AIII+5 μM的曲美替尼，加藥24 h后更換新鮮培養基繼續培養10 d，集落采用甲醇固定2 min后用吉木薩染料染色20 min，拍照觀察。

1.3.4 細胞遷移檢測 A549細胞以5×104個/孔的密度接種到24孔培養板中培養；24 h后細胞分為4組進行劃痕實驗，分別加入體積分數為2.5‰的DMSO(對照)、7.5 μM的知母皂苷AIII、5 μM的曲美替尼、7.5 μM的知母皂苷AIII+5 μM的曲美替尼；顯微鏡下拍照觀察并測量細胞間劃痕距離，即為0 h劃痕距離；藥物處理24 h后顯微鏡下拍照觀察并測量細胞間劃痕距離，即為24 h劃痕距離。細胞相對遷移率(%)=(實驗組0 h劃痕距離-實驗組24 h劃痕距離)/(對照組0 h劃痕距離-對照組24 h劃痕距離)×100%。

1.3.5 細胞周期檢測 A549細胞以每孔5×104萬個/孔的密度接種到6孔培養板中；24 h后細胞分為4組，分別加入體積分數為2.5‰的DMSO(對照)、7.5 μM的知母皂苷AIII、5 μM的曲美替尼、7.5 μM的知母皂苷AIII+5 μM的曲美替尼；加藥24 h后消化離心收集細胞，根據細胞周期檢測試劑盒的操作流程操作并于細胞流式儀檢測分析細胞周期。

1.2.6 數據統計分析 采用SPSS2.0軟件對三次重復實驗的數據進行方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞生長檢測 由圖2可知，當知母皂苷AIII單獨使用時，對肺癌A549細胞的生長抑制效應較為微弱(約為20%)，隨著作用時間的增加，抑制效果并未增強；但與曲美替尼聯用時顯著促進了曲美替尼對細胞的抑制效應，這種促進效應隨著藥物作用時間的增加而增加(P<0.05)，表明二者聯用對A549細胞的生長具有協同抑制效應。

注：與CON組相比，*P<0.05；與Tim組相比，★P<0.05；與Tra組相比，#P<0.05。圖2 A549細胞生長抑制效應

2.2 集落形成檢測 由圖3可知，知母皂苷AⅢ對A549細胞的集落形成無顯著改變，曲美替尼對A549細胞的增殖能力有一定程度的抑制，使集落數量和集落大小均減少；當知母皂苷與AⅢ曲美替尼聯合使用時，無集落形成，表明二者聯用時對細胞的增殖能力有很強的抑制作用。

圖3 集落形成

2.3 細胞遷移檢測 由圖4可知，與對照組相比，知母皂苷AⅢ對A549細胞遷移的抑制效應差異無統計學意義(P>0.05)，曲美替尼能顯著抑制A549細胞遷移(P<0.05)；當曲美替尼與知母皂苷AⅢ聯合使用時，抑制程度顯著高于曲美替尼單獨使用(P<0.05)，表明二者聯用對A549細胞的遷移具有協同抑制效應。

圖4 A549細胞遷移變化

2.4 細胞周期檢測 由圖5可知，知母皂苷AⅢ和曲美替尼單獨使用時均使A549細胞的細胞周期進程阻滯于G0/G1，雖然知母皂苷AⅢ提高了曲美替尼的阻滯效果，但差異無統計學意義(P>0.05)，表明知母皂苷AⅢ不能顯著提高曲美替尼對A549細胞的周期阻滯效果。

圖5 A549細胞周期變化注：與CON組相比，*P<0.05；與Tim組相比，★P<0.05。

3 討論

眾所周知，腫瘤細胞中的多種信號通路常常是異常活化的，導致了細胞增殖失控和凋亡受阻等，與腫瘤的發生發展有密切關系。目前，以信號通路為靶點的靶向藥物已普遍用于各種腫瘤的治療，但針對單一通路或單一靶點的藥物阻斷某一信號通路以后可能會導致其他信號通路反饋性激活而使腫瘤細胞逃逸藥物的作用，這是藥物療效逐漸下降的重要原因。聯合用藥同時作用于多個靶點，能產生更持久和有效的治療效果，同時也可以降低用藥量和減少毒副作用，已成為腫瘤治療的研究熱點。

曲美替尼(商品名：Mekinist)是RAS-RAF-MEK-ERK信號通路的抑制劑，于2013年被美國FDA批準用于治療BRAF V600E或V600k基因突變的黑色素瘤。在臨床二期試驗中，對存在KRAS突變的IV期肺腺癌患者應用曲美替尼治療，發現其治療效果與多西他賽的治療效果相近[6]。目前也有曲美替尼治療肺癌的臨床報道，患者的無進展生存時間達到6個月[7]，可見該藥具有治療肺癌的應用前景。有研究表明，曲美替尼作用于前列腺癌和結腸癌細胞后雖然抑制了ERK1/2的活性，卻導致STAT3信號的異常激活[8]；曲美替尼作用于胃癌細胞后在降低了ERK活性的同時也使STAT3信號升高，而在隱丹參酮與曲美替尼共同作用下，胃癌細胞中的ERK和STAT3信號則同時被抑制[9]；當曲美替尼與西妥昔單抗聯合用于結腸癌細胞時，可以有效抑制結腸癌細胞增殖并促進其凋亡，顯著提高 KRAS與BRAF突變型結腸癌細胞對西妥昔單抗的藥物敏感性，在體外實驗中二者也具有協同效應[10]，以上研究結果提示曲美替尼與其他藥物聯合使用可能更有益于腫瘤的治療。

知母為百合科植物知母的干燥根莖，是我國的傳統中藥，具有清熱瀉火、滋陰潤燥等功效[11]。知母含有豐富的皂苷類物質，單體皂苷有40余種[12]。知母皂苷AⅢ是其中一種單體皂苷，具有多種藥理作用，如抗腫瘤[13]、改善學習記憶功能[14]、抗凝血抗血栓[15]等。這些豐富的藥理作用提示知母皂苷AⅢ有廣闊的臨床應用前景，但對于不同的疾病，知母皂苷AⅢ發揮功能的有效濃度和作用機制也可能存在較大差異。

本研究發現，當知母皂苷AⅢ在較小的作用濃度下對A549細胞無明顯抑制效應時，卻能提高曲美替尼對 A549細胞的生長、增殖和遷移的抑制，提示知母皂苷AⅢ和曲美替尼對肺癌細胞具有協同抑制的效應。但知母皂苷AⅢ是否通過抑制了曲美替尼反饋性激活的STAT3信號或其他信號來促進曲美替尼的作用有待于下一步的驗證。此外，在動物水平是否存在該效應有待于建立動物的移植瘤模型和腫瘤轉移模型來進行驗證。由于中藥知母中皂苷類物質較多，知母中的其他種類皂苷物質是否也有相似的作用效應也值得探討。綜上所述，研究突出了聯合用藥治療肺癌的重要作用，提供了一種潛在的知母皂苷與曲美替尼聯合用藥治療肺癌的方案。本研究只是初步探索知母皂苷聯合曲美替尼對肺癌細胞A549的抑制活性，由本研究到臨床試驗還有很多問題需要解決，如知母皂苷聯合曲美替尼抑制肺癌細胞A549活性潛在的分子機制、信號途徑介導，以及動物水平是否有效等。