基于網絡藥理學探究中藥川芎治療高血壓的藥理作用機制

晏相如 丁雨點 李順利 楊豆豆 何緒華 蔣文雯

貴州大學藥學院，貴州 貴陽 550025

近10年來，隨著現代基因組學、蛋白質組學、代謝組學等“組學”理論的發展，系統生物學視角的引入以及生物信息學的應用,網絡藥理學 (Network Pharmacology) 概念應運而生[1-2], 它是在系統生物學與計算機技術高速發展的基礎上發展起來的, 基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡的基礎上, 通過網絡分析, 系統綜合地觀察藥物對疾病網絡的干預與影響, 揭示多分子藥物協同作用于人體的奧秘[3]。這與中醫學從整體的角度去診治疾病的理論, 中藥及其復方的多成分、多途徑、多靶點協同作用的原理殊途同歸, 無疑為跨越中西醫間的鴻溝架起了橋梁, 為中醫藥的現代化和國際化指明了方向。

川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖，具有活血行氣，祛風止痛的作用[4]。川芎主要含有揮發油、生物堿、有機酸等化學成分，有治療高血壓、抗血栓形成、抗氧化、神經保護、抗腫瘤等藥理作用[5-7],其在臨床上可用于治療心血管疾病、眩暈癥、腎臟疾病等[8-9]。高血壓是危害人類健康的疾病之一，隨著社會的發展，無論是老人或是小孩都有患高血壓的幾率，且患病的人數在逐漸增加[10]。課題組推測活血化瘀中藥川芎或許能“擾動/抑制”高血壓相關靶點網絡而對高血壓產生一定的治療效果，但其成分、靶點與作用機制等尚不明確。本研究依靠網絡藥理學探討川芎降血壓的作用靶點與可能的作用機制，為其抗高血壓的研究和臨床應用提供一定的科學依據。

1 方法

1.1 川芎有效成分的篩選 川芎具有多成分、多靶點協同的作用，本研究采用TCMSP數據庫進行川芎有效成分篩選，該數據庫包括中國藥典注冊的499種中藥，含29 384種成分，3 311個靶標和837個相關疾病，其特別的價值在于，它為每種化合物提供了藥物藥代動力學信息，如成藥相似性(DL)，口服生物利用度(OB)，血腦屏障(BBB)，腸上皮通透性(Caco-2)等參數。一般類藥性DL>0.18 、口服利用度OB>30%的分子具有較好的成藥可能，本研究根據中藥川芎的特性，設置DL>0.18, OB>30%，篩選其有效成分。

1.2 成分-靶點篩選 接下來通過已知的成分化合物，去尋找其可能作用的靶點。TCMSP數據庫采用的是 HIT數據庫預測算法SysDT 來獲得藥物靶點之間的關系。本研究首先利用TCMSP數據庫篩選得到預測的分子靶點，同時保存分子的mol2結構文件；在Swiss-prot數據庫里輸入分子名得到預測的靶點，并保存分子3D結構的sdf格式；pharmmapper數據庫應用潛在作用靶點反向預測，進行藥效因匹配預測靶點并打分，Z’-score越大說明可能性越大，輸入分子3D結構，提交并進行篩選得到分子的預測靶點。

1.3 疾病靶點收集 使用高血壓“hypertension”為關鍵詞在GeneCards(http://genecards.org)、CTD(http://ctdbase.org)、TTD(https://db.idblab.org/ttd)、OMIM(http://omim.org)數據庫力查找疾病靶點。

1.4 有效成分-疾病靶點 將上述所得成分的作用靶點與疾病靶點導入cytoscape進行merge分析，得成分-疾病交集靶點。Cytoscape 軟件源自美國系統生物學研究所，用于將生物分子交互網絡與高通量基因表達數據和其他的分子狀態信息整合在一起，其網絡圖包括節點(node)和邊(edge)，每個節點可以是基因、miNRA或蛋白質等，節點與節點之間的連接 (edge) 代表著這些節點之間的相互作用。

1.5 蛋白相互作用(PPI)網絡構建 研究蛋白之間的相互作用網絡，有助于挖掘核心的調控基因。String是一個根據實驗數據、從PubMed摘要中文本挖掘的結果和綜合其他數據庫數據等方法來研究蛋白相互作用的數據庫。將得到的交集基因輸入String中，以獲取PPI網絡圖。

1.6 基因通路構建 將所得靶基因導入DAVID數據庫，選擇P值小于0.05，進一步運用DAVID數據庫對網絡預測出的靶點所涉及的基因功能Gene-Ontology (GO) 進行注釋分析，并對相關通路(Pathway)進行KEGG 通路富集分析。

2 結果

2.1 主要成分信息 設置DL>0.18，篩選出川芎有效成分20個，再經文獻查閱發現阿魏酸、川芎嗪、藁本內酯是治療心血管疾病的有效成分，因此通過數據庫篩選和文獻查閱共得川芎有效成分23個。基本信息見表1。

表1 川芎有效成分

2.2 成分-靶點篩選與疾病基因收集 使用TCMSP、Swiss-prot、Pharmmapper三個數據庫對川芎有效成分潛在的作用靶點進行篩選收集，然后使用Uniprot數據庫將檢索到的所有靶點蛋白校正為其官方名稱(Officical Symbol)。共得到20個有效成分共167個作用靶點，其中3個成分沒有有效靶點。使用高血壓“hypertension”為關鍵詞在數據庫中查找，并將靶點名使用uniprot統一為基因名，共得到484個疾病靶點。

2.3 有效成分-疾病靶點 將以上所得成分的167個作用靶點與疾病484個靶點導入cytoscape進行merge分析，得到41個交集靶點，結果見圖1。

圖1 川芎治療高血壓的有效成分-疾病靶點網絡

2.4 蛋白相互作用PPI網絡分析 PPI網絡所得結果如圖2所示，將與高血壓有關的41個靶蛋白進行PPI互作分析，得到最主要的靶蛋白，其中degree=22的血管內皮生長因子A(VEGFA)；degree=20的轉錄因子AP-1(JUN)；degree=19的信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)、一氧化氮合酶(NOS3)、糖皮質激素受體(NR3C1)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2);degree=18的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、表皮生長因子受體(EGFR)；degree=17的原癌基因c-Fos(FOS)；degree=15的低氧誘導因子1-α(HIF1A)；degree=14的血紅素加氧酶1(HMOX1)、雄激素受體(AR)；degree=12的凝血酶原(F2)、細胞色素P4503A4(CYP3A4)等節點度值大，在其中發揮了關鍵作用，提示川芎可通過調節以上生長因子、受體、酶、信號轉導因子、激活因子、轉錄因子、誘導因子類關鍵靶蛋白，發揮治療高血壓的作用。

2.5 基因通路結果 將所得41個靶基因導入David數據庫，選擇P值小于0.05，基因通路構建所得GO結果見表2、KEGG結果見表3。

表3 KEGG信號通路

2.6 GO生物過程分析 如表2所示，將川芎治療高血壓發揮作用的41個靶基因進行GO生物過程富集，選擇P<0.05的與高血壓有關的GO生物過程，主要為：MAPK活性的正調控、腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路、平滑肌細胞增殖的正調控、細胞對激素刺激的反應、血管舒張的正調控、血壓的負調節、細胞增殖的負調控、鈣離子轉運的負調控、血管生成的正調控、血管收縮的正向調節等。提示川芎可能通過調控MAPK信號通路表達、阻斷血管收縮分子去氧腎上腺素等的生成、增加平滑肌細胞數量促進血管舒張、減少鈣離子進入細胞、促進血管生成和正向調節血管收縮等生物過程治療高血壓疾病。

2.7 KEGG信號通路分析 將川芎的41個靶點基因在David進行KEGG信號通路富集分析，根據P<0.05篩選得到影響心血管類疾病高血壓的相關信號通路15條，為了達到對基因進行注釋和分類的目的，將篩選得到的通路用Omicshare數據庫進行KEGG富集分析結果可視化，圖3所示。并將篩選所得通路與靶點用cytoscape作靶點-通路圖。分析篩選得到通路主要為：PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、鈣信號通路、雌激素信號通路、抗胰島素通路、VEGF信號通路、cGMP-PKG信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、多巴胺能神經突觸、前列腺癌通路等。

圖3 川芎治療高血壓疾病的相關通路富集圖

3 討論

高血壓屬于心血管疾病的常見疾病之一，嚴重威脅著人類的健康，其發病機制較為復雜。川芎辛散溫通，功能活血祛瘀，作用廣泛，適用于各種瘀血阻滯之病癥。本研究利用網絡藥理學對川芎治療高血壓的作用機制進行了預測，通過TCMSP、Swiss-prot、Pharmmapper、genecard、ctd等數據庫分別對成分靶點和疾病靶點進行篩選，并利用cytoscape軟件進行靶點與靶點相交繪制，發現川芎與VEGFA、HMOX1、PPARG、NOS3、FOS、PTGS2、JUN、HIF1A、STAT3、F2、CYP3A4、AR、EGFR、NR3C1等41個與高血壓相關的靶標蛋白相互作用，隨后進行PPI互作分析得到節點度較高的核心靶點：血管內皮生長因子A(VEGFA)、轉錄因子AP-1(JUN)、信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)、一氧化氮合酶(NOS3)、糖皮質激素受體(NR3C1)、前列腺素G/H合成酶2、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)以及表皮生長因子受體(EGFR)和原癌基因c-Fos(FOS)。其中VEGFA在血管生成中起積極作用，誘導使血管通透性增加，VEGFA分泌水平升高會引起血管平滑肌(VSMCS)增殖水平的上升，參與高血壓誘導的血管重建。高血壓患者的微循環至大血管均有不同程度的血管內皮受損發生， VEGFA具有促進血管內皮增生、新生血管生成以及增加血管通透性的功能，血管內皮能夠接受血液中的激素水平、壓力水平、炎癥介質等相關信號，這些信號的接受會使得血管內皮細胞分泌不同的生物活性物質用以調節血管內皮細胞功能，參與血管的收縮與舒張，進而調節局部血管功能的完整性[11]，從而控制血壓。HMOX1在生理條件下活性最高的是脾臟，趙寧等[12]在研究中發現HMOX1基因的rs59607267位點與原發性高血壓及血壓水平相關。NOS3通過cGMP介導的信號轉導途徑參與血管平滑肌舒張，產生的NO介導血管內皮生長因子(VEGF)誘導冠狀動脈血管生成，并通過激活血小板識別因子促進凝血，高鵬等[13]的研究發現NOS3基因14號內含子rs3918181多態性與高血壓的發生相關，進一步證實了該基因與高血壓發生的相關性。

通過KEGG通路分析，研究發現川芎主要通過HIF-1信號通路、鈣信號通路、VEGF信號通路、PI3K-Akt信號通路、cGMP-PKG信號通路、TNF信號通路、雌激素、胰島素抵抗以及前列腺癌等通路的調控以治療高血壓疾病。

血管損傷是一個慢性、低度炎癥反應的過程，它是高血壓、動脈粥樣硬化等多種心血管疾病發生和發展的始動環節及共同的病理學基礎[14]。有研究表明TNF-α即腫瘤壞死因子-α在原發性高血壓的發病機制中起重要作用，TNF-α不但參與機體的免疫防御功能，而且還是重要的炎癥促進因子，可通過多種途徑促進平滑肌細胞增殖，使平滑肌細胞內鈣快速升高，引起血管收縮，進而導致血壓升高[15]。

HIF-1是由HIF-1α和HIF-2β兩個亞基構成，HIF-1α 作為缺氧條件下的重要轉錄因子，調節血管的生成及細胞的凋亡和自噬，并參與調節多條信號通路。其中VEGF是受HIF-1直接調控的細胞生長因子，可通過與其特異性受體VEGFR結合激活酪氨酸蛋白激酶活性，促進新生血管的形成,提高血管通透性[16-17]。

PI3K/ Akt和其它一些下游通路可在壓力負荷誘導高血壓癥中被激活[18]，PI3K/ Akt信號通路在調控細胞凋亡增殖的信號通路中發揮重要作用，通過激活Akt及其下游靶點p53等，促進細胞周期進展、增殖、生存和抗凋亡，從而影響血管內皮的細胞凋亡,此外雌激素涉及到P13K-Akt通路生成血管舒張因子NO、影響MAPK通路進而調節血壓。

VEGF信號通路中VEGF因子是促血管新生作用最強的細胞因子, 不僅可以促進內皮細胞的增殖以及血管結構的形成，還能促進血流和血管通透性的改變。高血壓導致心肌肥大，是心臟自身針對血流動力學因素改變，通過自分泌和旁分泌調節而發生的一種適應性改變，有研究發現肥大的心肌細胞VEGF表達增強[19]。

鈣信號通路通過調節Ca2+通道，穩定血壓，鈣可以使外周血管阻力增加，從而導致血壓升高，也有研究認為鈣可以增加血管平滑肌細胞膜的穩定性，緩解精神緊張性血壓升高，降低血管內源性加壓素的反應，促進尿鈉排泄，減少血容量，解除Na-K-ATP酶的活性抑制，增強鈉和鉀的主動轉運，舒張血管平滑肌，降低血壓[20]。

川芎除主要作用于上述通路以外，雌激素可降低血管通透性和血清膽固醇，松弛素作為胰島素超家族的多肽激素之一，具有血管生成和舒張血管的作用，催產素能減少人體內腎上腺酮等壓力激素的水平，以降低血壓。

隨著科學研究的不斷深入，新的藥物靶點以及降壓藥不斷出現，使得高血壓疾病的治療得到更多的改善。此次研究結果初步闡釋了川芎治療高血壓的作用機制，為開展探索川芎治療高血壓疾病相關的藥效物質基礎以及藥理作用機制研究奠定了良好的基礎。