基于網絡藥理學的畬藥“十二時辰”治療類風濕性關節炎的機制研究

曾熙穎 張 云 左春蘭 林 凡*

1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122；2.福建教育學院理科研修部，福建 福州 350001；3.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122

類風濕性關節炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種常見慢性炎癥性關節疾病，可引起骨損傷以及殘疾。該疾病的發病率為0.03%，高發年齡段為35歲至50歲之間[1]。目前，RA的病因尚未完全清楚[2]，其病程遷延，呈慢性、侵襲性發展，復發率與致殘率高，易引發心血管疾病和其它并發癥，從而損害患者的生活質量[3]。RA的主要治療藥物為以甲氨蝶呤為代表的抗風濕藥物和腫瘤壞死因子α(TNF-α)抑制劑為代表的生物制劑，單獨或聯合用藥可減輕關節腫脹和疼痛、改善多種臨床癥狀，但目前尚無治愈性治療方案[4]。另一方面，胃腸和心臟毒性、注射部位感染、結核病和淋巴瘤患病風險的增加等毒副作用限制了抗RA藥物的使用[5]。同時，有許多患者對現有治療方法沒有反應[6]。因此，迫切需要開發新的有效療法。

畬藥“十二時辰”是毛茛科鐵線蓮屬重瓣鐵線蓮(ClematisfloridaThunb.var. plena D. Don)的干燥根[7]，其味辛，性溫，具有通關竅、通經活絡、活血止痛、祛風除濕等功效[8]，是一味頗具地方特色的閩東畬藥。RA在中醫屬“痹癥”范疇，《素問·痹論》中提及“風、寒、濕三氣雜至，合而為痹”，治療的基本原則為“風者疏之，寒者溫之，濕者驅之”，常用散風、驅寒、祛濕等性質的中藥治療[9]，而祛風除濕正是“十二時辰”的常用功效之一。另外，類風濕性關節炎急性期常呈現滑膜血管水腫、滲出性和細胞浸潤性病變，繼而導致腫脹疼痛，這些癥狀與“十二時辰”的主治相符。因此“十二時辰”對于RA可能具有療效。

本研究采用網絡藥理學的方法對“十二時辰”抗RA的有效成分及作用機制進行全面探討，闡釋其治療RA的可能機制，為后續研究提供理論支撐，拓展該藥的應用范圍。另一方面，該研究成果將有利于弘揚和繼承畬醫藥文化，推動畬醫藥產業發展。

1 材料與方法

1.1 獲取“十二時辰”化學成分 通過中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP數據庫)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)以及中藥綜合數據庫(TCMID數據庫)[10](http://www.megabionet.org/tcmid/search/)收集“十二時辰”的主要化學成分，結合文獻挖掘[11-13]并利用Pub Chem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和TCMSP數據庫對每個化學成分的分子結構進行驗證，確定“十二時辰”的已知化學成分。

1.2“十二時辰”靶點預測與RA疾病靶點查詢 利用TCMSP和TCMID數據庫獲取上述化學成分的靶點。將篩選得到的靶點導入UniProt數據庫(http://www.uniprot.org/)中進行檢索和轉換操作，得到與相關的靶蛋白或靶基因信息。

1.3“十二時辰”靶點與抗RA作用的相關性分析 將查詢得到的“十二時辰”預測靶點信息與DrugBank數據庫中美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準的抗RA藥物靶點進行映射分析，分析“十二時辰”預測靶點與抗RA作用相關性。

1.4“十二時辰化學成分-靶點”相互作用網絡的構建與分析 利用Cytoscape 3.7.1軟件，將檢索到的“十二時辰”化學成分與其在數據庫中獲取的潛在靶點生成“十二時辰化學成分-靶點”相互作用網絡，并進行網絡拓撲結構分析。

1.5 蛋白質—蛋白質互作(protein-protein interaction, PPI)網絡的構建與分析 從HPRD數據庫(http://www.hprd.org/)中獲取人體蛋白互作數據作為背景網絡[14]。利用1.3分析得到的“十二時辰”抗RA相關靶點與人體蛋白互作數據生成“十二時辰抗RA靶點-人體蛋白”PPI網絡，并進行網絡拓撲結構分析。

1.6“十二時辰”抗RA靶點的GO功能富集和KEGG通路注釋分析 采用David 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對所預測的“十二時辰”抗RA靶點進行GO(Gene Ontology)功能富集和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路注釋分析。

2 結果

2.1“十二時辰”化學成分的獲取 通過文獻檢索、TCMSP數據庫和TCMID數據庫共收集到“十二時辰”的化學成分共9種，各化學成分的基本信息見表1。從表中可見，在9種化學成分中，除齊墩果酸為皂苷類化合物外，其余8種均為揮發油成分。

表1 “十二時辰”化學成分的基本信息

2.2 “十二時辰”化學成分的潛在靶點信息及其治療RA的可行性分析 “十二時辰”的9種化合物共檢索到60個潛在作用靶點。將“十二時辰”的潛在作用靶點與DrugBank數據庫中檢索得到的1848個抗RA藥物靶點進行映射，結果得到21個重復靶點。這21個靶點占“十二時辰”總靶點數目的35%，提示“十二時辰”可能具有治療RA的功效，其基本信息(包括靶蛋白、靶基因、Uniprot號和頻次)見表2。其中凋亡調節因子Bcl-2(Apoptosis regulator Bcl-2)和前列腺素G/H合成酶1(Prostaglandin G/H synthase 1)在9個化合物中出現頻次均為5，前列腺素G/H合成酶2(Prostaglandin G/H synthase 2)的頻次為4，提示它們可能具有重要作用。

表2 “十二時辰”抗RA靶點信息表

2.3“十二時辰化學成分-靶點”相互作用網絡 將9個化合物及其潛在的靶點相連以構建“十二時辰化學成分-靶點”相互作用網絡，如圖1所示。該網絡包括68個節點(8個化合物和60個潛在靶點)和83條邊，而正二十一烷在數據處理過程中未發現相關靶點，故在構建的分子-靶點網絡中沒有顯示。在網絡中，連接化合物和靶點較多的節點可能起到重要的作用，是潛在的關鍵化合物和靶點。表3列舉了“藥物分子-靶點”網絡中的關鍵節點及其拓撲結構信息，即分子1308(油酸)有最多的潛在靶點(21個)，其次是分子0069(棕櫚酸)、分子1396(十五烷酸)、分子0263(齊墩果酸)分別有17、16、12個潛在靶點，提示它們可能是起關鍵作用的藥物分子。另外，度值(網絡中和節點相連的路線條數)較高的靶點為凋亡調節因子Bcl-2(P10415)、前列腺素 G/H合成酶1(P23219)、前列腺素G/H合成酶2(P35354)，分別有5、5、4個相互作用配體，并且通過與表1比對可發現這三個靶點均存在于映射得到的21個“十二時辰”與RA共同靶點中，提示Bcl-2、PTGS1、PTGS2等是“十二時辰”活性成分治療RA的主要靶點群。此外，在分子1308(油酸)作用靶點中包含關鍵靶點前列腺素 G/H合成酶1(P23219)和前列腺素G/H合成酶2(P35354)；在分子0069(棕櫚酸)和分子1396(十五烷酸)作用靶點中則均包含以上3個關鍵靶點。

表3 “十二時辰化學成分-靶點”相互作用網絡中關鍵節點信息表

表3 “十二時辰化學成分-靶點”相互作用網絡中關鍵節點信息表

另外，網絡的拓撲結構分析結果表明：網絡集中度為0.299，網絡密度為0.038，網絡異質性為1.594，最短路徑為2808(67%)，節點平均中介中心度為0.044，大于平均中介中心度的節點有10個。這說明“十二時辰”中含有的化合物可能作用于整個生物網絡系統，而非單一作用于某一個蛋白靶點，從而提示了“十二時辰”作用的整體性和復雜性。

注：淺色節點代表化學成分，深色節點代表靶點圖1 “十二時辰化學成分-靶點”相互作用網絡圖

2.4“十二時辰抗RA靶點-人體蛋白”PPI網絡構建與分析 以HPRD數據庫中獲取的人體蛋白互作數據作為背景網絡，與21個“十二時辰”抗RA靶點，構建“十二時辰抗RA靶點-人體蛋白”PPI網絡，如圖2所示。各靶點相應的度值見表4，根據表格可發現靶點Bcl-2、前列腺素 G/H合成酶1和前列腺素G/H合成酶2的度值排名均較靠前，結合2.3進一步證實了這3個靶點在“十二時辰”治療RA中具有重要作用。

注：深色節點代表“十二時辰”抗RA靶點，淺色節點代表人體蛋白圖2 “十二時辰抗RA靶點-人體蛋白”PPI網絡

表4 “十二時辰”抗RA靶點在“十二時辰抗RA靶點-人體蛋白”PPI網絡中的度值

2.5 “十二時辰”抗RA靶點的GO功能富集和KEGG通路注釋分析 利用DAVID平臺的GO和PATHWAY模塊對所預測的“十二時辰”抗RA靶點進行研究。在GO富集分析中，確定了38個GO條目(錯誤發現率，FDR<0.05)，如圖3所示。其中生物過程相關條目有22個，涉及炎癥反應、凋亡過程負調節、NF-κB轉錄因子活性正調節、一氧化氮生物合成正調節、細胞對腫瘤壞死因子的反應等方面；分子功能相關條目9個，涉及蛋白質同源二聚化活性、細胞因子活性、轉錄因子活性、序列特異性DNA結合等方面；細胞組成相關條目7個，涉及細胞質、核質、內質網等方面。

圖3 “十二時辰”化學成分抗RA相關靶點GO富集分析

在KEGG通路注釋分析中，篩選出顯著的前20條通路(P<0.05)，其中與RA關系密切的通路有5條(見表5)。在PI3K-Akt、Rheumatoid arthritis和Toll-like receptor這三條信號途徑的作用位點中均包含凋亡調節因子Bcl-2(P10415)；TNF 信號途徑的作用位點包含前列腺素G/H合成酶2(P35354)；MAPK信號途徑的作用位點包含前列腺素 G/H合成酶1(P23219)。提示“十二時辰”可能通過作用于這5條通路中的關鍵靶點而發揮抗RA的作用。

表5 “十二時辰”化學成分抗RA相關靶點的KEGG基因富集條目(Top 20)

表5 “十二時辰”化學成分抗RA相關靶點的KEGG基因富集條目(Top 20)

3 討論

RA是一種以關節中炎性細胞的積累導致持續性滑膜炎及骨質破壞為特征的自身免疫性疾病[2]，這與畬藥“十二時辰”在治療關節腫痛中所表現的炎癥充血和滲出反應有相似之處。中醫治療RA時常用具有驅寒、散風、祛濕等性質的中藥[9]，而祛風除濕、通絡止痛恰是“十二時辰”及其同屬植物的常用功效之一，如：黃花鐵線蓮(ClematisintricataBunge)可被用于治療RA[14]，威靈仙(ClematischinensisOsbeck.)總皂苷對大鼠佐劑性關節炎有較好療效[15]，單葉鐵線蓮(ClematishenryiOliv.)對II型膠原誘導型關節炎大鼠能緩解癥狀和改善病變，對RA有防治作用等[16]。本研究利用網絡藥理學方法分析得出“十二時辰”的9種化學成分和60個潛在作用靶點，其中35%潛在靶點與現有抗RA藥物靶點重合，提示“十二時辰”可能具有治療RA的功效。

對“十二時辰化學成分-靶點”相互作用網絡的拓撲學分析表明，“十二時辰”的關鍵化合物有油酸、棕櫚酸、齊墩果酸和十五烷酸。不飽和脂肪酸具有降低血栓形成、降低血小板黏附及抗脂質過氧化等作用[17]。油酸和棕櫚酸作為不飽和脂肪酸，可能在抗炎過程中起到減少血栓形成和抗氧化的作用。裴克等利用小鼠實驗證明油酸和棕櫚酸具有一定的抗炎、鎮痛作用[17]；其中棕櫚酸可能通過降低Bcl-2表達水平[18-20]，激活MAPK信號通路，活化p38、JNK、ERK，引起前列腺素G/H合成酶的表達升高[21]來發揮作用。齊墩果酸為五環三萜類化合物，具有多種藥理活性，體內外研究表明齊墩果酸具有顯著的抗炎活性[22-24]，它對IL-6、IL-8和MMP1等炎癥因子的表達有明顯的抑制作用，能明顯地抑制細胞外信號調節激酶、p38、c-jun N末端激酶和Akt蛋白的磷酸化，抑制IκB-α蛋白的降解[25]。

對“十二時辰化學成分-靶點”相互作用網絡的拓撲學分析還表明，“十二時辰”潛在抗RA關鍵性靶點為前列腺素G/H合成酶1、前列腺素G/H合成酶2和凋亡調節因子Bcl-2等。炎癥反應和成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)的異常活化增殖是RA發病的關鍵因素[26]。前列腺素G/H合成酶1、2又分別稱為COX-1和COX-2，其中COX-1與炎癥的發生有密切的關系，COX-2參與加劇炎癥進程[27]。有研究表明，通過抑制COX-2 表達和PGE2的合成，可減少炎性細胞因子的產生，抑制FLS細胞增殖，從而治療RA[28-29]。另外，凋亡調節因子Bcl-2的異常表達也可影響FLS的增殖/凋亡進而影響RA的病理過程。如體外研究結果發現RA模型細胞中Bcl-2水平明顯升高[30]。甲氨蝶呤等抗RA藥物的作用機制亦與降低Bcl-2表達水平相關[31-32]。這些報道的結果均與本研究結果相符。

進一步利用David數據庫對21個“十二時辰”潛在抗RA靶點進行GO功能富集和KEGG通路注釋分析。GO結果提示“十二時辰”治療RA相關基因功能主要體現在炎癥反應、凋亡過程負調節、NF-κB轉錄因子活性正調節、蛋白質同源二聚化活性等方面；KEGG結果表明“十二時辰”可能通過TNF信號、PI3K-Akt信號、Toll樣受體信號和MAPK信號等通路發揮治療RA的作用。其中，TNF信號通路(hsa04668)的TNF-α通過結合受體TNFR1和TNFR2而激活，激活的TNF信號通路可導致NF-κB核異位和JNK、p38、AP-1活化，活化白細胞、破骨細胞、內皮細胞、滑膜成纖維細胞等，誘導多種炎必性因子和基質酶的生成，導致滑膜炎癥反應，引起關節破壞[33]；PI3K-Akt信號通路(hsa04151)參與滑膜細胞的增殖與凋亡調節，在RA滑膜細胞中處于異常激活狀態[34]；Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRS)信號通路(hsa04620)通過介導細胞因子的合成與釋放，促進相關免疫分子的表達，活化免疫細胞，參與自身免疫性疾病過程[35]，其中TLR2和TLR4與RA的發病密切相關[36]；絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路(hsa04010)亦屬于典型RA相關信號通路，其中的ERK1/2、JNK和p38 MAPK等信號分子的上調可促進滑膜細胞增殖和分化，導致RA慢性滑膜炎[37]。此外，在直接相關的類風濕性關節炎(Rheumatoid arthrit)信號通路(hsa05323)上，“十二時辰”的作用靶點有Bcl-2(P10415)、IL-6(P05231)、ICAM-1(P05362)等RA相關因子，這再次提示Bcl-2在“十二時辰”潛在治療RA機制中的重要作用。

中醫藥抗RA的實驗研究亦證實了上述信號通路在抗RA中的重要性。如桂枝芍藥知母湯可下調膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠外周血TNF-α水平，誘導RA滑膜細胞凋亡[38]；青藤堿可抑制RA患者外周血樹突狀細胞(dendritic cells，DC)中TLR4和TLR2表達，抑制DC成熟和細胞因子分泌，阻斷T細胞異常活化，從而發揮治療RA的作用[39]。這些結果與本次研究的結果相一致，提示“十二時辰”可能通過上述信號通路發揮治療RA的作用。

由此可見，應用網絡藥理學方法分析得知“十二時辰”的化學成分油酸、棕櫚酸、齊墩果酸、十五烷酸可能通過Bcl-2、COX-1、COX-2等靶點調節TNF、PI3K-Akt、Rheumatoid arthritis、Toll-like receptor和MAPK 等多條信號通路，抑制成纖維樣滑膜細胞的異常增殖，減輕炎癥反應，達到治療RA的作用。