殼聚糖/聚乙烯醇/殼寡糖抑菌納米纖維膜的制備和性能研究

劉永旭， 張大偉

(東北林業大學 材料科學與工程學院， 黑龍江 哈爾濱 150040)

納米纖維膜具有孔隙率高、透氣性好、比表面積高等特性，被廣泛應用于儲能材料、組織支架、傷口敷料、食品包裝等領域[1-4]。在納米纖維的制備技術中，靜電紡絲因設備簡單可靠、操作方便、制備纖維直徑均一等優點，在實驗室和工廠被大量應用[5-8]。天然高分子及其衍生物的靜電紡絲納米纖維因具有良好的生物相容性和細胞黏附性，以及來源廣泛、價格便宜等優點，而日益受到研究者的關注。殼聚糖(CS)作為天然高分子材料甲殼素的脫乙酰基產物，具備較好的抑菌性、生物相容性、低抗原性、無毒無害等特性，這些特性使殼聚糖納米纖維膜在組織工程、傷口敷料、酶固定化、藥物傳遞、廢水過濾和抗菌藥物等很多領域中有巨大的發展前景[9-11]。殼聚糖分子間強烈的氫鍵作用，以及在酸性條件下的陽離子聚電解質的特性[12]，使得在靜電紡絲過程中，CS分子鏈間的正電荷群會形成較大的斥力，不利于CS的靜電紡絲，為此常將其與聚乙烯醇(PVA)、聚乳酸(PLA)、聚環氧乙烷(PEO)等聚合物[13-15]混合紡絲。其中，PVA因具備較好的水溶性、生物相容性和降解性能，而常用于靜電紡絲制備CS/PVA納米纖維膜。殼聚糖相對分子質量大、分子間作用力強制約了納米纖維膜的抑菌性，因此加強CS/PVA納米纖維膜的抑菌性和吸收性，將更有利于CS基納米纖維膜應用于生物醫用領域。殼寡糖(CHOS)作為殼聚糖降解得到的小分子衍生物，相對分子質量只有幾十到幾百，低相對分子質量的特性使其易溶于水、抑菌性強、吸收性好、生物活性高[16-17]，用CHOS改善殼聚糖納米纖維膜的抑菌性和吸收性是一個可行的研究方向。本研究以CS、PVA、CHOS為原料，采用靜電紡絲制備了搭載不同含量CHOS的CS/PVA納米纖維膜，并通過電鏡觀測、抑菌測試、水接觸角測試、溶解性能測試探究其各項性能，以便于CS/PVA/CHOS納米纖維膜材料在生物醫用領域有更廣泛地應用。

1 實 驗

1.1 原料與試劑

殼聚糖(CS)，脫乙酰度為91%，黏度100 mPa·s，浙江金殼藥物有限公司；聚乙烯醇(PVA)，醇解度為88%，聚合度為1 700，阿拉丁生化科技股份有限公司；殼寡糖(CHOS)，脫乙酰度為90%，黏度為10 mPa·s，浙江金殼藥物有限公司；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CMCC 26003，廣東省微生物保藏中心；PBS磷酸緩沖鹽溶液，pH值為7.4，實驗室自制；冰醋酸，天津致遠試劑有限公司；蒸餾水，哈爾濱市文景蒸餾水廠。

1.2 紡絲液的配制

取PVA粉末放入80 ℃水中配制成質量分數為5%的PVA水溶液；稱取一定量的CS粉末配制成懸浮液，并滴入等質量的冰醋酸，攪拌至CS完全溶解；然后再將CS懸浮液與5%的PVA溶液按比例混合，配制成CS與PVA的質量比分別為10 ∶90、 20 ∶80、 30 ∶70的溶液。再配制3組CS與PVA的質量比為20 ∶80的溶液，分別加入一定量的殼寡糖(CHOS)，攪拌使之溶解，配制成CS、PVA和CHOS質量比分別為20 ∶80 ∶2、 20 ∶80 ∶5和20 ∶80 ∶10的溶液。再將所配制的溶液倒入50 mL的離心管中，放入超聲波振蕩器中，功率為120 W，超聲波振蕩20 min，使溶液分散均勻，得到靜電紡絲液。

1.3 納米纖維膜的紡制

將配制好的靜電紡絲液注入10 mL的注射器中，注射器與水平線夾角為18°。使用高壓電源提供高壓電場，使用鋁箔作為納米纖維的負極收集板，正極為導線連接到注射器金屬針頭。在重力和電場的共同作用下，紡絲液從注射器針尖噴射出來形成納米纖維，并在負極板上逐漸被收集。經36 h的連續紡制，制備得到一定厚度的納米纖維膜。取制備的納米纖維膜放入80 ℃烘箱中12 h，烘干水分以備測試。以CS與PVA的質量比10 ∶90、 20 ∶80、 30 ∶70的紡絲液制備的CS/PVA納米纖維膜分別標記為CS/PVA-1、CS/PVA-2和CS/PVA-3；以CS、 PVA與CHOS質量比20 ∶80 ∶2、 20 ∶80 ∶5、 20 ∶80 ∶10的紡絲液制備的CS/PVA/CHOS納米纖維膜分別標記為CS/PVA/CHOS-1、 CS/PVA/CHOS-2和CS/PVA/CHOS-3。

1.4 納米纖維膜的表征

1.4.1掃描電鏡(SEM)觀測 將不同成分的納米纖維膜裁剪成0.5 cm×0.5 cm，通過JSM-7500F型掃描電子顯微鏡(日本電子株式會社)分析膜的微觀形態，并通過使用Digimizer軟件任選膜中80根纖維進行測量并計算纖維平均直徑及其標準差。

1.4.2紅外(FT-IR)測試 選擇納米纖維膜的原料和成纖效果較好、組分比例合適的納米纖維膜作為測試對象。使用TensorⅡ型紅外光譜儀(德國BRUKER光譜儀器公司)表征納米纖維膜的化學結構，光譜掃描范圍為4000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.4.3X射線衍射(XRD)測試 通過D/max-2200VPC型X射線衍射儀(日本理學電機株式會社)測定并分析納米纖維膜的結晶度，掃描速度為5(°)/min，掃描范圍(2θ)為5～55°。

1.4.4抑菌測試 將不同成分的納米纖維膜裁剪成1 cm×1 cm大小的試樣，放置于涂有金黃色葡萄球菌的瓊脂培養基表面，在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，觀察并使用Digimizer軟件測量培養皿中納米纖維膜周圍的抑菌圈大小，比較各納米纖維膜的抑菌性能。

1.4.5水接觸角測試 借助OCA 20接觸角測定儀(德國Dataphysics儀器股份有限公司)測量納米纖維膜的水接觸角，測量時水滴為5 μL，溫度為25 ℃，使用數碼相機記錄液滴的形狀，每個樣品試驗重復測量5次，取平均值。

1.4.6溶解性能測試 將不同成分的納米纖維膜裁剪成2 cm×2 cm大小的試樣，放入100 ℃烘箱中烘干，稱量并記錄質量(m1，g)，放于pH值為7.4、溫度為37 ℃的PBS溶液中(每組多個樣品)，在放置的第1、 4、 7天取出，取出試樣后在100 ℃環境下烘干2 h，并記錄殘余質量(mn，g)。每個樣品試驗重復測量5次，取平均值。質量殘留率(k，%)由下式計算：

k=mn/m1×100%

2 結果與分析

2.1 微觀形貌分析

不同成分和比例的CS/PVA、CS/PVA/CHOS納米纖維膜的掃描電鏡圖如圖1所示，平均直徑統計如表1所示。圖1(a)～(c)是不同質量比的CS/PVA納米纖維膜的電鏡圖，圖1(d)～(f)是搭載不同含量的CHOS的CS/PVA/CHOS納米纖維膜的電鏡圖。

m(CS) ∶m(PVA): a.10 ∶90； b.20 ∶80； c.30 ∶70

觀察發現，幾種不同的納米纖維膜中，均無明顯的串珠和缺陷存在，且纖維呈現無規則取向排列，纖維具有較好的連續性，這說明納米纖維膜具備較好的微觀形貌。由圖1(a)～圖1(c)并結合表1統計數據來看，當CS/PVA膜中的CS含量上升時，纖維的平均直徑也隨之上升，同時纖維直徑的不均勻程度，即標準差也呈現出逐漸增大的變化趨勢，這是由于在含有冰醋酸的酸性紡絲液中，CS分子鏈上的氨基會從溶液中結合氫離子，從而使殼聚糖成為帶陽離子的聚電解質，因此靜電紡絲過程中，紡絲液中CS分子鏈之間形成的正電荷群之間會產生較大的斥力，會增大納米纖維的成纖阻力，因此CS含量越高，纖維的直徑和不均勻度就越大[12]。

從圖1(d)～(f)中可以發現，CS/PVA/CHOS納米纖維膜也表現出均勻的微觀形貌。表1中的統計數據顯示，CS/PVA/CHOS納米纖維的平均直徑隨著CHOS含量的增加而有所降低，此外，纖維直徑的不均勻度(即標準差)也隨著CHOS的含量增加而減小，這與CS/PVA納米纖維直徑隨CS含量的變化規律正好相反。這主要是由于CHOS作為CS的小分子降解產物，在紡絲溶液中更易溶解和分散，因此在成纖過程中可紡性更好，所以當CHOS的含量增加時，溶液的可紡性也會增加，纖維在電場中能得到充分拉伸，纖維直徑也隨之變小且直徑分布更加均勻，可以有效改善納米纖維的成纖效果。

2.2 FT-IR分析

CS、 CHOS、 PVA、 CS/PVA-2以及CS/PVA/CHOS-3納米纖維膜的紅外光譜如圖2所示。純CS的紅外特征光譜曲線a中3357 cm-1處的峰屬于—NH2和—OH的特征峰[7]。1645和1538 cm-1處的特征峰分別屬于酰胺I和酰胺II基團的混合振動。C—O—C振動導致1152、 1067和1031 cm-1處出現特征峰，2920和1491 cm-1處出現的特征峰屬于—CH2和CH—OH伸縮振動[18]。

殼寡糖作為殼聚糖的降解產物，具有很多與殼聚糖相同的官能團。在圖2曲線b中可以看到3480 cm-1左右為羥基與胺基的締合峰，1640 cm-1為殼寡糖分子上酰胺基團振動吸收峰[20]。CS/PVA/CHOS納米纖維膜的紅外圖譜與CHOS、CS和PVA紅外圖譜相比沒有出現新的特征峰，因此推測殼寡糖在納米纖維膜中是以共混的形式存在，這有助于CHOS更容易釋放到環境中。

圖2 樣品的紅外光譜圖

2.3 XRD分析

CS粉末、純PVA、CS/PVA-2納米纖維膜以及CS/PVA/CHOS-3納米纖維膜的XRD圖譜如圖3所示。

a.CS； b.CHOS； c.PVA； d.CS/PVA-2； e.CS/PVA/CHOS-3

由圖3可知，純CS在2θ為19.8°處出現特征衍射峰[21]；而純PVA在2θ為16.0°和22.4°處出現2個 尖銳的衍射峰[22]。當CS與PVA共混紡絲后，由于CS與PVA以分子級形式混合，且膜中PVA含量遠高于CS，因而僅出現了PVA的衍射峰[23]。比較圖3中的4條曲線可以發現，隨著CHOS的添加，CS/PVA/CHOS納米纖維膜的峰寬變寬，峰形變尖，表明CHOS的加入使得CS/PVA納米纖維膜的結晶度發生變化。結晶度的變化推測有2個原因：一方面，在靜電紡絲過程中，被拉伸的纖維分子鏈以較高的拉伸速率迅速凝固，阻礙了晶體的形成[23-24]；另一方面，CS、PVA、CHOS分子間形成了較強的氫鍵作用力，增強了三者之間的相容性，也破壞了由相分離的PVA或CS產生的晶體結構[25]。晶體結構的破壞可能會在一定程度上降低納米纖維的強度，但對于提升納米纖維膜的吸水性及親水性有幫助，從而使殼寡糖更快地釋放到周圍環境中，使其抑菌性能得到提升，這一推論在后面的抑菌實驗、水接觸角實驗中能夠獲得支持。

2.4 抑菌性能測試

不同CS以及CHOS含量的CS/PVA和CS/PVA/CHOS納米纖維膜對金黃色葡萄球菌抑制能力如圖4 所示。從圖4中可以發現，在培養皿中6個試樣周圍均具有較明顯的抑菌圈，說明各納米纖維膜對金黃色葡萄球菌均有一定的抑制能力，其中CS/PVA/CHOS-3的抑菌圈直徑最大，說明其抑菌能力最為突出。

a.CS/PVA-1； b.CS/PVA-2； c.CS/PVA-3； d.CS/PVA/CHOS-1； e.CS/PVA/CHOS-2； f.CS/PVA/CHOS-3

從圖4中還可以發現，隨著殼聚糖的量從10%增加到30%，CS/PVA納米纖維膜的抑菌圈直徑從11.34 mm增大到14.58 mm，抑菌性能明顯增強。由于殼聚糖的抗菌機理主要在于其線型分子鏈上的氨基側基能結合H+而帶正電荷，從而能與細菌蛋白質中帶負電的部分結合，阻礙細菌吸收營養物質，使細菌失去活性[26]。因此制備的CS/PVA納米纖維膜試樣的抑菌性能與殼聚糖含量成正比。不同CHOS含量的CS/PVA/CHOS納米纖維膜的抑菌實驗表明，隨著CHOS含量的增加，納米纖維膜的抑菌圈直徑呈逐步變大的趨勢，相比未添加CHOS的CS/PVA-2膜，m(CS) ∶m(PVA) ∶m(CHOS)為20 ∶80 ∶10的CS/PVA/CHOS-3膜的抑菌圈直徑從12.32 mm增大到了17.11 mm，抑菌圈直徑擴大了38.9%。這是因為殼寡糖作為殼聚糖的小分子產物，結構和化學特性與CS基本一致，除了具備與CS相似的殺菌機理外，還能夠利用小分子特性滲透到細胞內部，破壞細胞內物質，導致細菌死亡[27]，這使得CHOS表現出更強的抑菌效果，所以制備的CS/PVA/CHOS納米纖維膜的抑菌性能會隨著CHOS含量的增加而增加。

2.5 水接觸角測試

不同CS以及CHOS含量的CS/PVA-1、CS/PVA-2、CS/PVA-3、CS/PVA/CHOS-1、CS/PVA/CHOS-2和CS/PVA/CHOS-3納米纖維膜的接觸角分別為75.1°、 59.8°、 41.7°、 55.1°、 47.2°和37.5°。CS/PVA納米纖維膜的水接觸角隨著CS含量的增加而減小，這是由于殼聚糖分子上帶有大量的—OH、—NH2等強極性官能團，是一種高度親水的高分子材料，因此隨著CS含量的增加，納米纖維膜的親水性增加，水接觸角減小。

CS/PVA/CHOS納米纖維膜的水接觸角隨著CHOS含量的增加而減小，CS/PVA/CHOS-3納米纖維膜的水接觸角相比于CS/PVA-2納米纖維膜，在搭載了10%的CHOS后，水接觸角由59.8°降到了37.5°，降低了37.3%，這是由于殼寡糖作為殼聚糖的小分子產物，在水溶液中有更好的溶解性和分散性，因而具有更好的親水性。因此隨著納米纖維膜中CHOS含量的增加，納米纖維膜具備更好的親水性能，水接觸角也因此變小。

親水性能是衡量生物醫用材料，特別是創傷敷料的一個重要指標，有研究表明，濕潤的傷口環境更有利于創傷的愈合[28]，因此親水性能好的納米纖維膜在創傷敷料領域能有更好地應用。

2.6 溶解性能測試

不同CHOS含量的CS/PVA/CHOS納米纖維膜在37 ℃的PBS緩沖液(pH值為7.4)中的溶解性能如圖5所示。從圖5可以發現，不同CHOS含量的納米纖維膜具有相似的溶解特性，即在初始的24 h內快速溶脹溶解，但在后續的時間里溶解速度較平緩。這是因為CS/PVA/CHOS納米纖維膜中的PVA在水溶液中會迅速遇水溶脹并溶解，導致納米纖維膜迅速大量失重。

圖5 納米纖維膜在pH值7.4緩沖液中的溶解性能Fig.5 Solubility of nanofibrous membrane in buffer solution with pH value 7.4

由圖5可以發現，不同CHOS含量的納米纖維膜的溶解性能有所不同，CHOS含量越高，納米纖維膜在相同時間內的溶解速度越快，質量殘留率也更低。不含CHOS的納米纖維膜第1天的質量殘留率為75.7%，第7天的質量殘留率為66.8%。但是當m(CS) ∶m(PVA) ∶m(CHOS)=20 ∶80 ∶10 時，納米纖維膜第1天的質量殘留率為58.6%，第7天的質量殘留率為41.0%，質量殘留率相比不添加CHOS時降低了38.6%，即溶解率提高了38.6%。即CHOS的加入加速了納米纖維膜的溶解。出現這種情況的原因是，CHOS具有極好的親水性和水溶性，因此含有CHOS的納米纖維膜在溶液中溶脹溶解速度加快。高溶解率的納米纖維膜質量殘留率更低，在作為創傷敷料使用時，可以減少在去除敷料時對皮膚造成的二次傷害[29]，因此可以更好地應用在傷口敷料等領域。

3 結 論

以CS、PVA和CHOS為原料，采用靜電紡絲的方式制備了不同CS和CHOS含量的CS/PVA和CS/PVA/CHOS納米纖維膜，并對納米纖維膜的微觀形貌、化學結構、抑菌性能、親水性能、溶解性能進行了測試和分析。研究發現：CS/PVA/CHOS納米纖維膜纖維直徑均勻，無串珠等缺陷；FT-IR測試表明，CHOS被混合在CS/PVA/CHOS納米纖維膜中；XRD測試表明，CHOS的加入促進了納米纖維膜中各組分之間的相容性；CHOS的加入提升了納米纖維膜針對金黃色葡萄球菌的抑菌性能，抑菌性能隨著CHOS含量增加而提高，m(CS) ∶m(PVA) ∶m(CHOS)=20 ∶80 ∶10的CS/PVA/CHOS納米纖維膜比m(CS) ∶m(PVA)=20 ∶80的CS/PVA納米纖維膜的抑菌圈直徑提升了38.9%。水接觸角測試表明，m(CS) ∶m(PVA) ∶m(CHOS)=20 ∶80 ∶10的CS/PVA/CHOS納米纖維膜相比m(CS) ∶m(PVA)=20 ∶80的CS/PVA納米纖維膜水接觸角下降了37.3%，CHOS的加入賦予了納米纖維膜更好的親水性。溶解性能測試表明CHOS的加入促進了CS/PVA納米纖維膜在溶液中的溶解，溶解率最大提升了38.6%。綜合來看，搭載有CHOS的CS/PVA納米纖維膜，相比于傳統的CS/PVA納米纖維膜擁有更好的抑菌性、親水性和溶解性，這將更有利于納米纖維膜在傷口敷料、組織工程等生物醫用方向的應用。