野豬源大腸桿菌的分離鑒定及腸毒素與耐藥性分析

趙 位，鄧 晴，喻 東，楊曉軍，楊 森，蔣 海，唐 浩，張清宇，張曉敏，龍 梅，羅 燕

(1.四川農業大學 動物醫學院，成都 611130；2.四川臥龍國家級自然保護區管理局，四川汶川 623006)

大腸桿菌(Escherichiacoli)是定植于人和動物腸道、呼吸道內的重要條件性致病菌，在自然界中廣泛存在，自Escherich于1885年首次分離到該菌以來，在人、家禽、家畜及野生動物機體中也分離到了該菌[1-2]。大量研究表明，大腸桿菌致病菌株能夠對人和動物產生致病，常引起嚴重敗血癥、腹瀉以及水腫等多種臨床癥狀[3]。其中，產腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是引起嬰兒和幼畜腹瀉的一種重要病原菌。在畜牧養殖中，ETEC常引起仔豬、牦牛、犢牛、羔羊、雞等多種動物腹瀉，初生幼畜常常因ETEC引起的劇烈水樣腹瀉和脫水而死亡，發病率和死亡率均很高，給養殖業帶來嚴重的經濟損失[4]。研究發現，ETEC首先通過黏附性菌毛對宿主的腸上皮細胞進行黏附，然后大量增值并產生不耐熱腸毒素(Heat labile enterotoxin，LT)或耐熱腸毒素(Heat stable enterotoxin，ST)，進而發揮致病作用[4]。

在多種ETEC宿主中，仔豬尤為易感。在家豬研究中，Verdonck等[5]于2002年就對比利時斷奶仔豬感染ETEC進行報道，并對F4型ETEC和F18型產Vero毒素大腸埃希氏菌(Verocytotoxin-productionEscherichiacoli,VTEC)引起機體的免疫反應進行比較，結果證實，F4型ETEC能夠更早地引起豬機體產生IgA、IgM和IgG。Do等[6]也報道越南北部ETEC引起大量斷奶仔豬腹瀉。在國內，周雙德等[7]對豬ETEC進行報道，并針對豬ETEC常見毒素LTⅠ、STa和VT2e建立了多重PCR檢測方法。謝俊偉等[8]對河南某豬場患腹瀉2月齡仔豬進行病原研究證實，該豬場腹瀉是由豬瘟與ETEC的混合感染引起。而在野豬的相關研究中，有關于產志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli)、腸致腸病性大腸桿菌(EnteropathogenicEscherichiacoli)、腸出血性大腸桿菌(EnterohemorrhagicEscherichiacoli)的報道[9-10]。目前，國內外鮮見ETEC在野生野豬上的報道。本研究從四川省臥龍自然保護區野豬糞便中分離出1株大腸桿菌，對其進行生化和16S rRNA基因分子鑒定，并通過藥敏試驗、特異性毒力基因和耐藥基因擴增，以期對其分類及耐藥性進行分析，為ETEC在野豬上引起腹瀉的防控和治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Luria-Bertani(LB)培養基、麥康凱培養基、Mueller-Hinton(MH)培養基以及藥敏紙片等均購自杭州微生物試劑有限公司；2×TaqPCR MasterMix Kit、糞便基因組DNA提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化試劑(北京)有限公司；PCR反應的引物合成以及產物測序，均由杭州有康生物科技有限公司完成；家豬血液樣品為四川農業大學動物檢疫實驗室 保存。

1.2 野豬糞便樣品采集及分子鑒定

采集四川省臥龍自然保護區7份野豬糞便，保存于4 ℃凍存盒中，并立即送往實驗室，然后采用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便總DNA，并參照文獻引物(表1)，對總DNAcytb基因及致瀉性大腸桿菌特異性基因Stx1、Stx2、LT、ST Ⅰ、STⅡ、EaeA和ial進行PCR擴增。同時，設置家豬血液DNAcytb基因對照[11]。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至有康生物科技有限公司進行測序，并將測序結果進行在線比對。

1.3 菌株分離

將致瀉性大腸桿菌特異性基因擴增陽性的野豬糞便樣品進行梯度稀釋后涂布于麥康凱培養基平板上，每個梯度做3個重復，麥康凱培養基平板置于37 ℃恒溫培養箱，培養24 h后挑選單菌落進行劃線純化，然后進行革蘭染色，確定為純培養物后，以甘油保存于-70 ℃冰箱，備用。

1.4 菌株生化鑒定

將菌種劃線接種于LB瓊脂培養基，培養 16 h后觀察菌落顏色、形態，并采用細菌微量生化反應管依據《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行生化鑒定，操作步驟按照細菌微量生化反應管說明書 進行。

1.5 菌株16S rRNA基因擴增

將純化好的菌種接種于LB培養基，37 ℃培養16 h，利用細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA，作為PCR反應模板，應用通用引物(表1)對16S rRNA基因進行PCR擴增。PCR反應體系參照文獻[12]進行，PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至有康生物科技有限公司進行測序，并將測序結果進行在線比對。

1.6 菌株毒力基因和耐藥基因的擴增

利用提取的菌株DNA為模板，參照SN/T 3640-2013設計引物，對該菌株可能攜帶的Stx1、Stx2、LT、STⅠ、STⅡ、EaeA、ial等毒力基因進行PCR擴增。同時，對其可能攜帶的耐藥基因mecA、blaOXA、blaIMP、blaDHA、ant(4′,4′)、tetA、tetB、sulⅠ、sulⅡ、aph(3′)-Ⅱa、aac(3′)-Ⅱa、carO、KPC-2和blaNDM等進行PCR擴增，特異性擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至有康生物科技有限公司進行測序，測序結果進行在線比對，引物相關信息見表1。

1.7 藥敏試驗

將純培養的菌液經活菌計數，調整活菌數為 2.4×108CFU/mL，無菌棉簽均勻涂布于MH培養基，待稍干后用無菌鑷子將20種藥敏紙片分別貼在培養基表面，然后置37 ℃恒溫培養16～ 18 h，游標卡尺測定抑菌圈直徑。藥敏結果參照CLSI進行判定。

2 結果與分析

2.1 糞便總DNA分子鑒定

以提取的7份野豬糞便總DNA和家豬血液總DNA為模板，分別進行cytb基因擴增。結果顯示(圖1)，采集的7份野豬糞便總DNA和家豬cytb基因PCR擴增產物大小均為635 bp，與預期結果一致。將目的條帶膠回收后測序，比對結果顯示二者相似性為99.98%。在線比對分析表明，糞便cytb基因擴增產物與數據庫收錄的豬cytb基因相似性最高。cytb基因PCR擴增證實，采集的7份糞便均為野豬糞便。對7份野豬糞便總DNA進行致瀉性大腸桿菌特異性基因擴增結果顯示，7份糞便樣品總DNA中Stx1、Stx2、LT、ST Ⅰ、EaeA和ial基因擴增均為陰性，而1份糞便樣品ST Ⅱ基因為陽性，其擴增產物大小約為421 bp (圖2)，與數據庫中收錄的大腸桿菌STⅡ基因(KY581591.1)相似性為98.64%。

2.2 細菌的分離培養

對1份STⅡ基因陽性野豬糞便進行培養 16 h后，在麥康凱培養基，形成大量紅色、邊緣光滑、濕潤的菌落，在LB平板上面可見乳白色、圓形、表面光滑、直徑約2 mm的菌落。革蘭染色可見紅染的直桿菌，菌落形態及革蘭染色結果見圖3。

2.3 菌株的生化性質

各項生化指標檢測試驗發現，分離菌株發酵葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、麥芽糖、棉籽糖、木糖均產酸產氣；鳥苷酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶呈陽性；苯丙氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、氧化酶、尿素酶、山梨醇和側金盞花醇呈陰性；不產H2S，VP試驗為陰性(表2)。以上結果符合大腸桿菌的生化 特征。

表1 本研究使用的引物信息Table 1 Information of primers in this study

M.DL2000 plus DNA marker；1.家豬血液DNA cyt b基因擴增；2～8.7份野豬糞便DNA cyt b基因擴增

M. DL2000 DNA marker；1～7.7份野豬糞便DNA STⅡ基因擴增

圖3 分離菌株的在LB上菌落形態(A)、麥康凱上的菌落形態(B)與革蘭染色結果(C)Fig.3 Colony morphology of isolate on LB plate(A) and Maconkey agar plate(B) and Gram staining results(C)

表2 分離菌株生化鑒定結果Table 2 Results of biochemical identification of isolated strains

2.4 菌株16S rRNA基因序列分析

分離菌株16S rRNA基因PCR擴增產物大小約為1 400 bp，瓊脂糖凝膠電泳結果見圖4。將目的條帶膠回收后測序，結果表明該菌 16S rRNA基因大小為1 397 bp。將序列提交至GenBank數據庫(登錄號：MN368163)，并在 NCBI上對該序列進行Blast比對分析，結果顯示，該分離菌的16S rRNA基因序列與大腸桿菌LD91-1菌株(登錄號：CP042585.1)的16S rRNA基因序列覆蓋度和相似性均為100%。因此結合生化試驗和16S rRNA基因分析，確定該菌種為大腸桿菌。

2.5 菌株毒力基因和耐藥基因的擴增

對分離菌株部分毒力基因和耐藥基因進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示(圖5)，該分離菌株基因組中攜帶耐熱腸毒素基因STⅡ。而耐藥基因擴增表明，該分離菌株基因組中mecA、blaOXA、blaIMP、ant(4′,4′)、tetA、tetB、aph(3′)-Ⅱa、carO和KPC-2擴增為陽性，電泳條帶與預期大小相符(圖6)。毒力基因和耐藥基因擴增產物測序結果在線比對證實，其與GenBank數據庫中相應的毒力基因和耐藥基因序列一致。

M.DL2000 plus DNA marker；1.16S rRNA；2.空白對照

M.DL2000 DNA marker；1. STⅠ；2. STⅡ；3.LT； 4. Stx1；5. Stx2；6.EaeA；7.ial

M.DL2000 DNA marker；1.mecA；2.tetA；3.tetB；4. aac(3′)-Ⅱa；5. sulⅠ；6. sulⅡ；7. aph(3′)-Ⅱa；8.blaDHA；9.blaIMP； 10. ant(4′,4′)；11.blaOXA；12.blaNDM；13.carO；14. KPC-2

2.6 藥敏試驗

參照CLSI藥敏紙片擴散法對菌株進行藥物敏感性試驗，結果參照CLSI進行判定。表3顯示，分離菌株對紅霉素、四環素、頭孢拉定、頭孢他啶、奧格門丁、林可霉素、氨芐西林和氨曲南8種藥物具有抗性，對阿米卡星、頭孢唑啉、頭孢曲松、鏈霉素、氧氟沙星、慶大霉素、諾氟沙星、氯霉素、復方新諾明和亞胺培南10種藥物敏感，而阿奇霉素和多粘菌素藥敏結果為中介。

3 討 論

在自然界中，大腸桿菌廣泛存在于人和動物腸道、呼吸道以及土壤、水、農產品中，也是一類重要的人畜共患病原菌，當人或動物機體抵抗力下降或當攜帶某些毒力因子的大腸桿菌侵入腸道和呼吸道外組織或其他器官時，就會引起感染[16]。可引起腹瀉的大腸桿菌被稱為致瀉性大腸桿菌，其往往攜帶某些重要的毒力因子[17]。臨床上，致瀉性大腸桿菌的準確鑒定，對腹瀉病的防治尤為重要，傳統上往往采用血清型鑒定對致瀉性大腸桿菌與正常大腸桿菌進行區分，而大量報道表明，血清型鑒定存在可重復性低、工作量大、成本高等特點[18-20]。研究表明，致腹瀉的5類大腸桿菌中，除了彌散粘附性大腸桿菌，其余4種致瀉性大腸桿菌均具有特定的毒力因子[21]。因此，通過不同致瀉性大腸桿菌特定毒力因子的PCR擴增檢測，能夠快速、準確地對其進行區分。本研究通過PCR擴增致瀉性大腸桿菌特定毒力因子，發現一株分離于野豬糞便的大腸桿菌攜帶有耐熱腸毒素STⅡ基因，證實該分離株屬于致瀉性大腸桿菌中的產腸毒素大腸桿菌(ETEC)。ETEC可同時攜帶耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素，也可僅攜帶耐熱腸毒素或不耐熱腸毒素，在新生兒和幼畜腹瀉中檢出率極高，常引起的劇烈水樣腹瀉和脫水[3]。目前，尚未有野生野豬上分離ETEC的報道。通過糞便形態特征和cytb基因序列分析，證實采集的糞便為野豬糞便。而從野豬糞便的狀態、顏色、形狀上看，并沒有出現腹瀉癥狀，這可能與宿主機體狀況以及糞便中ETEC的數量存在關系。

表3 分離菌株藥敏試驗結果Table 3 Results of drug sensitivity of isolated strains

臨床上，抗生素是進行大腸桿菌病治療的的首選方法。但是隨著抗生素的不合理使用，導致了大腸桿菌耐藥性和耐藥譜增加，從而增加了臨床大腸桿菌疾病治療的困難。本研究對四川省臥龍自然保護區野豬糞便中分離出的一株大腸桿菌耐藥情況分析發現，14種耐藥基因中，四環素類耐藥基因tetA和tetB、大環內酯類耐藥基因mecA、β-內酰胺類耐藥基因blaOXA、blaIMP、carO和KPC-2以及氨基糖苷類耐藥基因aph(3′)-Ⅱa和ant(4′,4′)均為陽性。而藥敏試驗表明，該分離株為多重耐藥菌株，其對紅霉素、多種β-內酰胺類、四環素類等藥物具有抗性，不過仍然對β-內酰胺類的頭孢唑啉、頭孢曲松、亞胺培南等藥物敏感。亞胺培南作為碳青霉烯類常見抗生素，是目前臨床治療多重耐藥性革蘭陰性菌感染的重要抗生素[22]，而碳青霉烯水解酶的出現，使很多菌株對碳青霉烯類抗生素產生抗性，其中KPC型碳青霉烯酶作為β-內酰胺酶的重要成員被廣泛關注[23]，此外，carO基因編碼膜孔蛋白，也能夠影響菌株對β-內酰胺類藥物的敏感性[24]。本研究中，雖然分離菌株均攜帶KPC-2和carO基因，但是藥敏結果顯示，菌株對亞胺培南仍敏感，可見耐藥基因型與表型之間存在差異，這可能存在耐藥基因未表達或發生突變等情況，其具體原因還需要進一步研究探討。

野生動物生活方式特殊，發病較少，人為影響也較少，其受抗生素的影響的可能性也較低。然而，隨著抗生素的大量使用及人為對野生動物活動區域的影響，越來越多的野生動物源致病菌均表現出耐藥性。本研究首次對臥龍自然保護區野生野豬源多重耐藥產腸毒素大腸桿菌進行報道。在其他野生動物上也有耐藥性大腸桿菌的報道，在四川地區圈養長頸鹿、蜂猴、金絲猴、黃虎等多種野生動物源大腸桿菌的耐藥性分析發現，圈養野生動物源大腸桿菌對多種磺胺類藥物都表現出耐藥[25]。Pavlickova等[26]對分離自家雞和野雞、野鴨的105株大腸桿菌耐藥基因進行比較發現，野雞和野鴨源大腸桿菌主要攜帶CEF、CXM、CTX等頭孢類藥物耐藥基因。此外，在黑鳶、海鷗、狼和狐貍等多種野生動物上均發現多重耐藥大腸桿菌[27]。可見，野生動物源大腸桿菌耐藥性已經比較普遍，這對于養殖業的發展和人類的健康存在重大隱患，值得引起關注和重視。

綜上所述，本研究通過對野生野豬源大腸桿菌的分離鑒定、藥敏試驗、致病類型、耐藥基因進行系統研究，在野生野豬糞便中分離出1株多重耐藥產腸毒素大腸桿菌，為野豬源病原菌的致病性及耐藥性研究奠定基礎。