孕穗期冷水灌溉對(duì)寒地粳稻相關(guān)生理指標(biāo)及葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

張盛楠，賈 琰，瞿炤珺，楊 亮，李 曉，張 妍，王 喆，趙宏偉

(1.寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030)

水稻作為中國(guó)主要的糧食作物，對(duì)保證國(guó)內(nèi)糧食安全發(fā)揮著重要作用[1]。黑龍江省是主要的粳稻產(chǎn)區(qū)，但其位于中國(guó)最北端，年平均氣溫較低，導(dǎo)致低溫冷害現(xiàn)象頻繁發(fā)生，對(duì)黑龍江省糧食生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。因此，低溫冷害已經(jīng)成為影響寒地粳稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的氣象災(zāi)害之一。

水稻是喜溫作物，在孕穗期對(duì)溫度十分敏感[2]。水稻在孕穗期遭受低溫冷害脅迫會(huì)影響正常生理代謝過(guò)程，表現(xiàn)出結(jié)實(shí)率低，產(chǎn)量下降[3]。Kuk等[4]研究表明，冷脅迫顯著增加水稻苗期功能葉片抗氧化酶的活性，其中CAT活性增加最為顯著。朱珊等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在孕穗期低溫脅迫下水稻內(nèi)源激素發(fā)生顯著性變化。Taylor等[6]研究表明，低溫脅迫會(huì)對(duì)葉綠體超微結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重影響。目前大量研究集中于低溫脅迫對(duì)水稻苗期生長(zhǎng)發(fā)育及生理代謝過(guò)程等方面[7-8]，而對(duì)水稻孕穗期相關(guān)生理指標(biāo)、葉綠體超微結(jié)構(gòu)及產(chǎn)量的研究還相對(duì)較少。因此本試驗(yàn)采取冷水灌溉方式，大田模擬自然條件下低溫冷害，以粳稻品種‘東農(nóng)428’和‘松粳10’為試驗(yàn)材料，研究孕穗期冷水灌溉對(duì)寒地粳稻耐冷相關(guān)指標(biāo)、葉綠體超微結(jié)構(gòu)及產(chǎn)量的影響，為解決寒地粳稻孕穗期低溫冷害問(wèn)題提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用經(jīng)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所前期篩選出的生育期相近的耐冷型品種‘東農(nóng)428’(‘DN428’)和冷敏感型品種‘松粳10’(‘SJ10’)為試驗(yàn) 材料[9]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城實(shí)驗(yàn)基地(東經(jīng)127.04°，北緯45.52°)進(jìn)行。4月13日播種，5月20日移栽。采用裂區(qū)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以不同時(shí)間冷水灌溉處理為主區(qū)，在孕穗期(幼穗長(zhǎng)約1 cm)進(jìn)行0(正常灌溉)、5、10和15 d的冷水灌溉處理，分別記為CK、D5、D10、D15。以粳稻品種為副區(qū)，設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)副區(qū)面積為18 m2。插秧規(guī)格為30 cm×10 cm，行長(zhǎng)6 m，每3株為1穴。在2018年7月12日進(jìn)行冷水灌溉，采用自動(dòng)冷水灌溉系統(tǒng)進(jìn)行冷水灌溉處理，冷水灌溉溫度為17 ℃(為黑龍江省孕穗期低溫冷害溫度)。灌水深度在20 cm[9]左右。冷水灌溉的時(shí)間為6：00-20：00。以正常灌溉為對(duì)照，處理結(jié)束后恢復(fù)正常灌溉，正常灌溉為曬水池中水(22～24 ℃)。其他同一般大田管理。采用田間氣候自動(dòng)測(cè)定儀測(cè)定大田氣溫、土壤溫度(深度10 cm)、光照輻射量，具體信息見(jiàn)表1。

表1 孕穗期冷水灌溉期間田間試驗(yàn)條件Table 1 Field test conditionunder cold water stress at booting stage

1.3 取樣方法

生理指標(biāo)：選取各處理生長(zhǎng)整齊一致的植株進(jìn)行標(biāo)記，孕穗期開(kāi)始進(jìn)行冷水灌溉處理，處理結(jié)束當(dāng)天8:00-10:00取樣，取水稻植株最上面的完全展開(kāi)葉，3次重復(fù)，放在-80 ℃冰箱保存，備用。

葉綠體超微結(jié)構(gòu)：選取各處理生長(zhǎng)整齊一致的植株進(jìn)行標(biāo)記，孕穗期開(kāi)始進(jìn)行冷水灌溉處理，處理結(jié)束當(dāng)天8:00-10:00取樣，選取水稻植株最上面的完全展開(kāi)葉進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，葉片剔除中間葉脈，切割成1 mm×3 mm的切片若干，放入戊二醛固定液中保存，在H-760型透射電子顯微鏡下觀察拍照。

產(chǎn)量：于成熟期，各處理選取2 m2實(shí)割，3次重復(fù)，收獲后自然風(fēng)干，脫粒測(cè)定每公頃的實(shí)際 產(chǎn)量。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目和方法

1.4.1 抗氧化系統(tǒng) 稱取0.5 g水稻葉片，加入5 mL(pH=7.8)的磷酸緩沖液，冰浴研磨成勻漿，在10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上清液用于抗氧化酶活性測(cè)定。超氧化物歧化酶(SOD)的活性采用氮藍(lán)四唑法[10]測(cè)定，過(guò)氧化物酶(POD)的活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定[10]。過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法[10]測(cè)定。

1.4.2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì) 可溶性糖(SS)采用蒽酮-硫酸比色法[13]，稱取0.5 g水稻葉片，加入4 mL 80%酒精研磨成勻漿，倒入離心管中，80 ℃水浴鍋中水浴30 min，在5 000 r/min離心機(jī)下離心10 min，收集上清液，其殘?jiān)? mL 80%酒精重復(fù)提取1次，合并上清液，上清液中加入適量活性炭，80 ℃水浴鍋中脫色20 min，過(guò)濾后吸取濾液進(jìn)行測(cè)定。

可溶性蛋白(SP)采用考馬斯亮藍(lán)法[14]，稱取0.5 g水稻葉片，加入5 mL(pH=7.8)的磷酸緩沖液，冰浴研磨，在10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上清液用于可溶性蛋白含量測(cè)定。

1.4.3 內(nèi)源激素 采用酶聯(lián)免疫測(cè)定法[15]測(cè)定脫落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素核苷(ZR)含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

以3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值為試驗(yàn)數(shù)據(jù)。Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，SPSS 22.0進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和方差分析，使用RStudio進(jìn)行相關(guān)性分析作圖。

2 結(jié)果與分析

如表2所示，所測(cè)指標(biāo)處理間和品種間均差異顯著。處理和品種互作間方差分析表明，CAT、GA3和產(chǎn)量之間差異不顯著，其余指標(biāo)均差異顯著。

表2 處理和品種之間的方差分析Table 2 Analysis of variance between treatment and variety

2.1 孕穗期冷水灌溉對(duì)寒地粳稻抗氧化酶系統(tǒng)的影響

在孕穗期冷水灌溉下，水稻啟動(dòng)保護(hù)酶系統(tǒng)，通過(guò)消除體內(nèi)多余的自由基來(lái)減輕冷水脅迫造成的傷害。由圖1可知，與對(duì)照相比，‘DN428’和‘SJ10’在冷水灌溉下，功能葉片中SOD、POD、CAT活性顯著上升，均隨冷水灌溉時(shí)間增加而呈上升趨勢(shì)，上升幅度也隨冷水灌溉時(shí)間而增加，在D15處理下達(dá)到最大值，具體表現(xiàn)為D15處理下‘DN428’功能葉片SOD活性增幅為32.11%，POD活性增幅為31.81%，CAT活性增幅為 27.69%，‘SJ10’增幅分別為28.40%、20.86%、 27.15%。‘DN428’在冷水灌溉處理下，SOD、POD、CAT活性在各處理中差異顯著?！甋J10’功能葉片CAT活性在冷水灌溉各處理下差異顯著，而SOD、POD活性在D10和D15處理下差異不顯著。‘DN428’功能葉片在冷水灌溉處理下抗氧化酶系統(tǒng)增幅大于‘SJ10’，說(shuō)明‘DN428’功能葉片抗氧化酶系統(tǒng)比‘SJ10’能更快速的響應(yīng)冷水脅迫。

2.2 孕穗期冷水灌溉對(duì)寒地粳稻活性氧含量的影響

顯著性分析中同一品種不同處理和對(duì)照之間一起比較，不同字母之間表示差異顯著(P≤0.05)。下同。

圖2 孕穗期冷水灌溉下寒地粳稻含量變化Fig.2 Changes of H2O2 contents in japonica rice under cold water irrigation at booting stagein cold region

2.3 孕穗期冷水灌溉對(duì)寒地粳稻滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖3可知，與對(duì)照相比，‘DN428’和‘SJ10’在冷水灌溉下，SS和SP含量顯著上升。在孕穗期冷水灌溉下，‘DN428’和‘SJ10’功能葉片中SS和SP含量隨著冷水灌溉時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，增幅也隨冷水灌溉時(shí)間而增加，均在D15處理下達(dá)到最大值，具體表現(xiàn)為D15處理下‘DN428’功能葉片SS含量增幅為34.83%，SP含量增幅為 48.97%，‘SJ10’功能葉片SS含量增幅為44.69%，SP含量增幅為29.39%?！瓺N428’功能葉片SS和SP含量在各冷水處理下差異顯著，‘SJ10’功能葉片SS含量在各冷水處理下差異顯著，而SP含量在D10和D15處理下無(wú)顯著差異。

圖3 孕穗期冷水灌溉下寒地粳稻SS和可SP含量變化Fig.3 Changes of soluble sugar and soluble protein content in japonica rice under cold water irrigation at booting stagein cold region

2.4 孕穗期冷水灌溉對(duì)寒地粳稻內(nèi)源激素含量的影響

由圖4可知，‘DN428’和‘SJ10’功能葉片中，內(nèi)源激素ABA在各冷水處理下與對(duì)照相比顯著上升，經(jīng)過(guò)冷水灌溉后，‘SJ10’功能葉片中ABA含量隨冷水灌溉時(shí)間的增加而顯著上升，在D15處理下達(dá)到最大值，在D15處理下增幅為 30.96%。而‘DN428’功能葉片ABA含量在D5處理下最大，D10和D15處理差異不顯著，在D5處理下增幅為24.87%。從圖4中IAA、GA3、ZR含量表明，除‘DN428’的D5處理與對(duì)照差異不顯著外，‘DN428’和‘SJ10’各處理中功能葉片IAA、GA3、ZR含量均顯著小于對(duì)照，且隨著冷水灌溉時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)，具體表現(xiàn)為‘DN428’功能葉片IAA、GA3、ZR含量在D15處理下降幅為10.98%、25.64%、35.09%，‘SJ10’降幅分別為20.87%、36.49%、46.39%。兩品種中功能葉片IAA含量在D10和D15處理下無(wú)顯著差異?！瓺N428’功能葉片中GA3和ZR含量在D10和D15處理下差異不顯著，而‘SJ10’各冷水處理下差異顯著。

圖4 孕穗期冷水灌溉下寒地粳稻內(nèi)源激素含量變化Fig.4 Changes of endogenous hormones in japonica rice under cold water irrigation at booting stagein cold region

2.5 孕穗期冷水灌溉對(duì)寒地粳稻葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖5-A、5-E，在CK下，‘DN428’和‘SJ10’葉綠體結(jié)構(gòu)完好，呈橢圓形或者紡錘形緊貼在細(xì)胞壁上，類囊體片層均很清晰，‘SJ10’葉綠體內(nèi)部有少量的淀粉粒存在。研究表明，葉綠體在遭受低溫冷害脅迫后，會(huì)表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)混亂，膨大，內(nèi)部類囊體片層結(jié)構(gòu)解體或消失[16]。在D5處理下(圖5-B、5-F)，‘DN428’和‘SJ10’葉綠體均出現(xiàn)少量的嗜鋨粒，兩品種中葉綠體結(jié)構(gòu)與對(duì)照并未出現(xiàn)明顯差異，‘DN428’葉綠體內(nèi)部出現(xiàn)少量淀粉粒。在D10處理下(圖5-C、5-G)，‘DN428’和‘SJ10’葉綠體和類囊體腫脹或變細(xì)長(zhǎng)，出現(xiàn)大量的嗜鋨粒，且‘SJ10’出現(xiàn)質(zhì)壁分離現(xiàn)象。在D15處理下(圖5-D、5-H)，葉綠體結(jié)構(gòu)不規(guī)則且與細(xì)胞壁之間存在明顯空隙，可觀察到葉綠體和類囊體腫脹，葉綠體類囊體片層模糊，‘SJ10’葉綠體內(nèi)部呈現(xiàn)空泡化，嗜鋨粒明顯增多。

2.6 孕穗期冷水灌溉對(duì)寒地粳稻產(chǎn)量的影響

由表3可知，與對(duì)照相比，孕穗期冷水灌溉下寒地粳稻的產(chǎn)量均顯著下降，各處理之間差異顯著，且隨著冷水灌溉時(shí)間的增加下降幅度逐漸增大?！瓺N428’在D5、D10、D15處理下產(chǎn)量較CK分別下降15.81%、25.64%、37.87%?！甋J10’在D5、D10、D15處理下產(chǎn)量較CK分別下降 19.27%、33.58%、47.94%?！瓺N428’各冷水處理下產(chǎn)量CRI為62.13%～84.19%，‘SJ10’各冷水處理下產(chǎn)量CRI為52.06%～80.73%。由此可見(jiàn)孕穗期冷水灌溉處理對(duì)‘SJ10’產(chǎn)量影響比‘DN428’大。

A.‘DN428’-CK;B.‘DN428’-D5；C.‘DN428’-D10;D.‘DN428’-D15;E.‘SJ10’-CK;F.‘SJ10’-D5;G.‘SJ10’-D10;H.‘SJ10’-D15

2.7 孕穗期冷水灌溉下相關(guān)生理指標(biāo)之間的相關(guān)分析

由圖6可知，內(nèi)源激素ABA與抗氧化酶、活性氧物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與其他3種內(nèi)源激素呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。IAA與抗氧化酶、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。GA3與活性氧物質(zhì)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，ZR與活性氧物質(zhì)、SOD、POD、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系或顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。從整體上來(lái)看，ABA是與耐冷相關(guān)生理指標(biāo)相關(guān)性最大的內(nèi)源激素。

2.8 孕穗期冷水灌溉下寒地粳稻相關(guān)生理指標(biāo)與產(chǎn)量的回歸分析

表3 孕穗期冷水灌溉后寒地粳稻的產(chǎn)量Table 3 Yield of japonica rice in cold region under treatment of cold water irrigation at booting stage

x,y軸代表相關(guān)生理指標(biāo)，顏色代表相關(guān)系數(shù)(紅色代表正相關(guān)，藍(lán)色代表負(fù)相關(guān)，顏色越深代表相關(guān)性越高),* 表示在 0.05水平上顯著相關(guān)。**表示在0.01水平上顯著相關(guān)

表4 孕穗期冷水灌溉下寒地粳稻相關(guān)生理指標(biāo)CRI與產(chǎn)量CRI的關(guān)系Table 4 Relationship between CRI and yield CRI of related physiological indexes of japonica rice in cold regionunder cold water irrigation at booting stage

3 討 論

內(nèi)源激素是一種有機(jī)化合物，在逆境脅迫下能調(diào)節(jié)植物自身生理過(guò)程[27]。Davies[28]認(rèn)為，植物的內(nèi)源激素具有復(fù)雜的生理效應(yīng)，既有協(xié)同作用，又有拮抗作用。邵怡若等[29]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物受到低溫脅迫的情況下，ABA含量升高。這與本研究結(jié)果一致，可能原因是在冷水灌溉下，寒地粳稻功能葉片細(xì)胞膜受到破壞，導(dǎo)致功能葉片電子滲透率增加，ABA含量的增加可以降低水稻植株生長(zhǎng)勢(shì)，對(duì)低溫脅迫做出相應(yīng)的適應(yīng)性反應(yīng)[30]。在孕穗期冷水灌溉處理下，IAA、GA3和ZR含量下降，原因可能為促進(jìn)型植物激素含量下降，可以延緩植物生長(zhǎng)速度，維持體內(nèi)代謝平衡。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，冷敏感型水稻‘SJ10’內(nèi)源激素ABA在冷水灌溉下上升幅度大于耐冷型水稻‘DN428’，而冷敏感型水稻‘SJ10’內(nèi)源激素IAA、GA3和ZR含量比耐冷型水稻‘DN428’下降幅度要大，分析認(rèn)為冷敏感型水稻在受到冷水脅迫后具有較強(qiáng)合成ABA的能力，促進(jìn)植物進(jìn)入休眠狀態(tài)。同時(shí)促進(jìn)型植物激素(IAA、GA3和ZR)含量下降，降低水稻細(xì)胞伸展性，減少因冷水灌溉帶來(lái)的傷害。從抗氧化系統(tǒng)與內(nèi)源激素的相關(guān)分析可知，內(nèi)源激素ABA對(duì)抗氧化系統(tǒng)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)相關(guān)性最大。徐新娟[31]指出ABA在低溫脅迫下會(huì)使植物產(chǎn)生較多的H2O2，促進(jìn)植物氣孔關(guān)閉，減少蒸騰作用，進(jìn)而改變植株體內(nèi)各種生理生化效應(yīng)。本研究表明ABA可以促進(jìn)植物抗氧化酶活性的增加，來(lái)抵御逆境脅迫。從可溶性糖和可溶性蛋白與內(nèi)源激素相關(guān)分析可知，在冷水灌溉下ABA含量的增加可以提高SS和SP含量，用于維持植物細(xì)胞滲透壓平衡[32]。

葉綠體是主要的光合細(xì)胞器，它含有豐富的類囊體膜。在正常灌溉下，葉綠體呈橢圓形或者紡錘型緊貼在細(xì)胞壁上，類囊體片層清晰可見(jiàn)[33]。在冷水灌溉下，葉綠體結(jié)構(gòu)不規(guī)則且與細(xì)胞壁之間存在明顯空隙，葉綠體和類囊體腫脹，類囊體片層模糊。從‘DN428’和‘SJ10’葉綠體超微結(jié)構(gòu)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，冷水灌溉下，‘DN428’葉綠體超微結(jié)構(gòu)損傷較輕，有少量淀粉粒出現(xiàn)。分析認(rèn)為，活性氧物質(zhì)主要的產(chǎn)出地是葉綠體，葉綠體超微結(jié)構(gòu)受損程度取決于活性氧物質(zhì)含量及抗氧化酶活性高低[34]。同時(shí)‘DN428’淀粉粒的出現(xiàn)是對(duì)冷水脅迫做出的適應(yīng)反應(yīng)。由于‘DN428’在冷水灌溉下比‘SJ10’具有高的抗氧化酶活性和低的活性氧水平，因此葉綠體超微結(jié)構(gòu)損傷程度較輕。

4 結(jié) 論