冠突散囊菌散茶發花工藝提高茯茶品質

耶玉婷，茍擁軍，李長風，駱婭婷，胡慶元，陳衛鋒，孟永宏

（1.陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安 710062；2.西安市長安區氣象局，陜西西安 710199；3.陜西省生物農業研究所，陜西西安 710043）

茶葉以其采制時間不同可分為春茶、夏茶和秋茶[1]。夏秋季節氣溫高、日照強，細胞內代謝水平較高，茶葉中酚/氨比值較大，茶葉苦澀味重、口感差，品質不及春茶，但是其茶多酚、花青素、咖啡堿含量高，營養價值大[2]。如能通過加工技術改善夏秋茶滋味，提高大眾接受度，將有效帶動夏秋茶生產、提高茶農的經濟收入。目前，降低夏秋茶苦澀味主要方法有以下3種：一是選擇持嫩性好、酚/氨比低的鮮葉原料；二是通過遮陰、施肥等栽培手段改善茶葉品質成分[3-5]；三是通過加工工藝的改進來促進茶葉品質成分的轉化[6-8]。試驗利用微生物發酵技術，對茶葉成分進行轉化，減少苦澀味，改善其滋味和口感，以期創新一種新型的茯茶制造工藝，開發有特色的夏秋茶新產品，最終促進夏秋茶資源的有效利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

夏秋茶、茯磚茶，陜西涇陽茶廠提供；茯散茶，實驗室自制。

沒食子酸、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG） 6種標準品，分析純，Sigma公司提供；聚乙烯醇、葡萄糖對照品、石油醚（沸程30～60℃）、氧化鎂、甲醇，色譜純；18種氨基酸標品（茶氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸），分析純，西安晶博生物科技有限公司提供；咖啡堿標準品，分析純，陜西帕尼爾生物科技有限公司提供。

1.1.2 儀器與設備

755B型紫外可見分光光度計，西安盛大儀器設備有限公司產品；真空冷凍干燥器，北京四環科學儀器廠產品；高效液相色譜儀，美國Waters公司產品；全自動氨基酸分析儀，日本HITACHI公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 冠突散囊菌的分離純化

參照胡治遠等人[9]的方法，采用察氏培養基，從陜西涇陽茶廠茯磚茶中分離冠突散囊菌，于27.5℃下恒溫培養，挑選長勢較好的菌落，采取平板劃線分離法，重復3～4次，得純培養的冠突散囊菌株。-80℃冰箱中甘油管保藏。

1.2.2 “散茶發花”制作茯散茶工藝

將冷凍管菌種接入察氏培養基，27.5℃恒溫條件下進行菌種活化。活化后的菌種接入PDA培養基，于27.5℃下恒溫培養得到斜面菌種。以夏秋茶和夏秋茶質量50%的純凈水為種子培養基，27～29℃恒溫條件下，將菌種接入種子培養基進行擴培，得到三角瓶菌種。在相同條件下接種到發酵曲盤進行發酵，培養周期根據預試驗確定，然后在80～90℃條件下烘干。

1.2.3 茶葉水提取物的制備及其含量測定

精確稱取20.0 g磨碎茶樣，加雙蒸水煮沸，水沸騰后煮茶3次，每次600 mL，每次30 min。趁熱過濾，合并3次濾液，減壓濃縮，于真空冷凍干燥機中干燥成粉末后，取出稱量。得夏秋茶、茯磚茶、茯散茶水提取物分別為25.5%，25.6%，24.5%。

1.2.4 茶葉中多酚類物質含量的測定

（1） 茶葉中茶多酚含量的測定。采用Folin Ciocalteu比色法[10]，堿性條件下，酚類物質中的酚羥基能將Folin Ciocalteu試劑中的鎢鉬酸還原，生成藍色配合物，顏色的深淺與多酚含量呈正相關。

式中：A——測試液吸光度；

V——樣品體積，mL；

W——水提取物含量，%；

SLOPEstd——沒食子酸標準曲線的斜率；

d——稀釋因子；m——取樣量，g。

（2）茶葉中兒茶素的測定。采用超高效液相色譜法[11]，色譜柱為Waters Acquity-BEH C18柱（1.7 μm，50 mm×2.5 mm）；流動相為乙腈和0.1%甲酸，采用梯度洗脫，乙腈洗脫質量濃度和時間為：9%（0）-9% （4 min） -12% （6 min） -25% （8 min） -9%（9 min） -9% （9.5 min），流速 0.25 mL/min，柱溫30℃，進樣量10 μL，檢測時間9.5 min，二極管陣列檢測器，檢測波長278 nm。

式中：C1——兒茶素質量濃度，μg/mL；

V1——樣品總體積，mL；

W——水提取物含量，%；

m——試樣質量，g。

1.2.5 茶葉中可溶性糖含量的測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法[12]，0.5 mL葡萄糖溶液中加入0.005 g/mL的3,5-二硝基水楊酸試劑1.5 mL，沸水浴中保持5 min，定容后放置20 min后測量，檢測波長為550 nm。

式中：M1——查曲線所得水解后還原糖，mg；

W——水提取物含量，%；

d——稀釋因子；

M——樣品質量，mg。

1.2.6 茶葉中咖啡堿含量的測定

采用高效液相色譜法[13]，色譜柱為Symmetry C18Column（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫 30 ℃，檢測波長275 nm，總流速1 mL/min，進樣量20 μL，流動相A：乙酸與去離子水混合溶液（V乙酸∶V去離子水=1∶500）；流動相B：乙腈，梯度洗脫程序：0～30 min，90%A～60%A。

式中：C1——咖啡堿質量濃度，μg/mL；

V1——樣品總體積，mL；

W——水提取物含量，%；

m——試樣質量，g。

1.2.7 茶葉中粗脂肪含量的測定采用索氏提取法，參照GB/T 14772—2008。

式中：M2——提取前試樣和濾紙的質量，g；

M1——提取后試樣和濾紙的質量，g；

M——稱取的試樣質量，g。

1.2.8 茶葉中氨基酸組分的測定

參照GB/T 5009.124—2003，采用全自動氨基酸分析儀，內標法定量，測定氨基酸組分。采用高效液相色譜法[14]，色譜柱為Diamonsil C18（46 mm×250 mm，5 μm）；以乙酸銨溶液和乙酸銨、甲醇、乙腈的混合溶液 （V乙酸銨∶V甲醇∶V乙腈=1∶2∶2）作為流動相，流速1 mL/min，進樣量20 μL，柱溫為25℃，檢測波長338 nm，外標法定量，測定茶氨酸含量。

式中：C1——茶氨酸質量濃度，μg/mL；

V1——樣品總體積，mL；

W——水提取物含量，%；

m——試樣質量，g。

1.2.9 茶葉品質感官評價

參照GB/T 23776—2009《茶葉感官審評方法》，對夏秋茶、茯磚茶、茯散茶的外形、湯色、香氣、滋味和葉底進行特征描述和打分，總分按外形30%，湯色10%，滋味25%，香氣25%，葉底10%加權平均計算。

茶葉評分標準見表1。

表1 茶葉評分標準

2 結果與分析

2.1 “散茶發花”制作茯茶

冠突散囊菌和壓制后的茯散茶（冠突散囊菌（a），茯散茶 （b）） 見圖 1。

由圖1可知，冠突散囊菌菌落為較規則的圓形，顏色為金黃色，菌落中央厚度略高于邊緣，中心有小隆起，結構較致密。

采用方法1.2.2中的散茶發花工藝，將菌種接入淺盤進行發酵，對發酵過程進行觀察。

不同發酵時間的茯散茶見圖2。

發酵第1天，茶葉無明顯變化；發酵第2天，茶葉間有白色菌絲產生；發酵第3天，茶葉上出現大量黃色孢子，冠突散囊菌生長旺盛；發酵第4天，茶葉上均勻覆蓋大量黃色孢子，發酵比較完全；發酵第5天，茶葉上金黃色的孢子顏色變暗，此時冠突散囊菌因發酵時間過長，產生大量褐色代謝產物。考慮到生產成本和發酵效果，散茶發花的發酵時間應控制在3～4 d為最佳。發酵成熟的茯散茶表面有金黃色孢子著生，發花均勻，具有明顯發酵香味和陳香。為了方便飲用，將制成的茯散茶壓制成型（見圖 1（b））。

2.2 多酚類物質含量測定

采用1.2.4方法測量夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中的總多酚含量及兒茶素含量。

夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中茶多酚和兒茶素的含量見圖3。

由圖3可知，3種茶的多酚含量分別為11.9%，10.1%，8.0%。發酵后，茯磚茶多酚含量較夏秋茶下降了15.2%，茯散茶下降了32.6%，茯散茶的多酚含量下降幅度是茯磚茶2倍。此外，加工后的茯磚茶和茯散茶中兒茶素各組分變化較明顯，茯磚茶中EGC，EC，EGCG，GCG，ECG分別降低了29.0%，5.3%，29.7%，45.4%，27.8%，其中GCG減少最多，C增加了12.6%，總體下降了8.8%；在茯散茶中EGC，EC，EGCG，GCG，ECG分別降低了29.6%，26.5%，74.3%，19.2%，61.7%，其中EGCG、ECG的含量下降最明顯，C上升了24.3%，總體下降了19.85%。從兒茶素含量下降幅度來看，茯散茶是茯磚茶的2倍，這是由于“散茶發花”過程中，冠突散囊菌分泌胞外酶[15]，可加速茶多酚和兒茶素的生物轉化，促進其氧化產物茶黃素、茶紅素及茶褐素的形成與積累，導致茶葉中多酚類物質含量降低。

2.3 發酵對夏秋茶中可溶性糖、咖啡堿和粗脂肪含量的影響

茶葉中的糖類物質包括單糖、寡糖、多糖及少量其他糖類，對增進茯磚茶滋味的甘厚純和口感具有十分重要的作用。對發酵4 d后的茯散茶，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測得3種茶中可溶性糖含量。

夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中可溶性糖、咖啡堿和粗脂肪含量見圖4。

由圖4可知，夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中可溶性糖含量分別為3.1%，3.0%，2.4%，即茯磚茶中可溶性糖含量在加工過程中下降了5.1%，茯散茶下降了24.1%，茯散茶下降幅度大約是茯磚茶的5倍。這是由于茯散茶在發花過程中冠突散囊菌大量繁殖，需可溶性糖作為碳源，進行代謝轉化，滿足自身生長發育。

咖啡堿，屬生物堿類物質，是茶葉中含量最高的有機化合物，是茶葉的主要呈味物質和生理活性成分[16]。采用1.2.6方法對3種茶葉的咖啡堿含量進行測定。由圖4可知，夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中咖啡堿含量分別為2.2%，2.6%，2.3%，茯磚茶較夏秋茶升高了18.6%，茯散茶中咖啡堿含量有所增加，但變化不大。Wang X G等人[17]研究表明，在茶葉發酵過程中，霉菌可以增加咖啡堿的含量，而酵母則降低其含量，因此茯磚茶中咖啡堿含量增加可能是由于在茶葉發酵過程中微生物繁殖產生代謝產物。

采用索氏抽提法對3種茶葉的粗脂肪含量進行測定。由圖4可知，夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中脂肪含量分別為1.4%，1.3%，1.4%，茯磚茶相對于夏秋茶下降了6.3%，茯散茶相對于夏秋茶下降了1.7%。由此可以看出，茯磚茶和茯散茶在整個加工過程中，脂肪含量都變化不大。脂肪下降的原因可能是茶葉發酵過程中，微生物能分泌的脂肪酶能夠將部分脂肪水解成脂肪酸，從而導致脂肪含量下降。

2.4 發酵對夏秋茶中氨基酸含量的影響

茶葉中富含多種氨基酸，茶氨酸是其中特殊的一種，為茶樹的次生代謝產物，在一般植物中較為罕見。氨基酸是茶葉滋味與香氣形成的重要前體物質，其組成、含量、降解產物和轉化產物也直接影響茶葉品質，如其含量的增多能改善茯茶的鮮爽味[18]。采用全自動氨基酸分析儀，內標法定量，測定3種茶葉中的氨基酸組分。

夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中氨基酸組分含量見表2。

由表2可知，在茯磚茶和茯散茶加工過程中，各氨基酸組分的變化程度有所不同，但總體趨勢都是下降的，分別下降了11.3%，42.6%。含量較多的茶氨酸（The）、谷氨酸（Glu）、天門冬氨酸（Asp）在茯磚茶和茯散茶中分別減少了37.4%，92.8%，且茶氨酸減少最多。其原因為茯茶在發酵過程中，以冠突散囊菌為主的一系列微生物,需消耗大量氨基酸來作為氮源和碳源，以滿足自身生長繁殖和生命代謝，從而導致部分氨基酸含量下降。但是，人體必需的氨基酸蛋氨酸（Met）、纈氨酸（Val）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His） 在茯磚茶中依次增加了21.1%，29.5%，7.6%，5.0%，在茯散茶中依次增加了41.5%，37.2%，24.4%，24.0%，這些氨基酸含量增加的原因是冠突散囊菌菌體和其代謝產物中新生成了部分人體必需氨基酸。

2.5 茶葉感官評價結果

表2 夏秋茶、茯磚茶、茯散茶中氨基酸組分含量/mg·kg-1

茶葉感官評價是判斷茶葉品質優劣和品質特征的重要手段與方法[19]。根據GB/T 23776—2009茶葉感官評價方法，分別對夏秋茶、茯磚茶、茯散茶的外形、水色、香氣、滋味和葉底進行特征描述并進行打分[20]。

夏秋茶、茯磚茶、茯散茶茶湯的感官評價雷達圖見圖5。

由圖5可知，3種茶葉感官得分出現很明顯的差別：夏秋茶得分最低，品嘗時香氣淡薄，以粗青氣為主，茶湯有明顯苦澀味；茯磚茶得分中等，以陳香為主，青氣基本被轉化，發花較好的茯磚茶帶菌花香，苦味基本轉化，略帶粗澀味；茯散茶得分最高，香氣以菌花香為主，出現陳香，滋味陳醇略厚，茶湯回甘明顯。

茯散茶湯色鮮亮、滋味陳醇、回甘明顯的主要原因有：一是茯散茶中更多的糖類物質通過脫水、縮合、聚合發生焦糖化反應，產生了更為怡人的湯色和焦糖香；二是茯散茶中水浸出物含量高，尤其是多酚類物質及其氧化產物含量豐富，多酚類氧化物茶褐素滋味稍甜，茶紅素呈甜醇味[21]，且對發酵茶的紅艷湯色有積極作用[22-23]；三是茯散茶中胞外酶及次生代謝產物會使兒茶素進行生物轉化，降低了兒茶素對口腔的收斂與干澀刺激，有效改善了茶湯的滋味與回甘[24]。

3 結論

采用冠突散囊菌進行淺盤接種和散茶發花技術，4 d內即可完成茯散茶的加工過程。通過對夏秋茶、茯磚茶和茯散茶中幾種主要成分含量的分析，發現散茶發花技術相比于傳統加工技術更能徹底、有效地轉化夏秋茶中多酚類物質、可溶性糖、脂肪、氨基酸，減少茶湯苦澀味，改善茶葉品質。該技術將對夏秋茶資源的有效利用，提高茶農經濟收益和茶業發展具有重要意義。