洋參御糖方對(duì)高糖損傷心肌微血管的干預(yù)作用

隋艷波，王鈺

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱)

0 引言

糖尿病是一種威脅全人類健康的疾病[1]。糖尿病慢性并發(fā)癥也是糖尿病基礎(chǔ)研究和臨床防治的重點(diǎn)和難點(diǎn)，其中糖尿病微血管病變是糖尿病慢性并發(fā)癥共同的病理基礎(chǔ)和核心關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病微血管病變不僅限于糖尿病患者，往往發(fā)生得更早、更廣泛，在糖尿病前期階段就可出現(xiàn)[2]。因此，深入研究糖尿病微血管病變的病理機(jī)制及藥物防治，對(duì)延緩和改善病理進(jìn)程及預(yù)后，降低病死率有著重要的臨床意義[3]。本研究選用洋參御糖方，在前期動(dòng)物研究及臨床實(shí)踐證實(shí)其安全有效基礎(chǔ)上[4]，進(jìn)一步研究洋參御糖方對(duì)高糖大鼠心肌微血管基底膜厚度、VEGFR-1、eNOS蛋白影響，闡述該方防治糖尿病微血管病變的機(jī)理，為洋參御糖方推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，為臨床選藥和新藥開(kāi)發(fā)提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

80只SPF級(jí)健康Wistar雄性大鼠，均購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

中藥飲片包括黃芪、西洋參、玉竹、麥冬、烏梅、白芍、山藥、葛根、女貞子、龜板、山萸肉等，上述飲片均購(gòu)自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司；鹽酸二甲雙胍片，商品名：格華止；生產(chǎn)批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)號(hào)H20023370；生產(chǎn)廠家：中美上海施貴寶制藥有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

鏈脲佐菌素 (批號(hào)s-0130，AIGMA公司)；血糖試紙(美國(guó)強(qiáng)生公司)；血清胰島素放免法試劑盒(南京建成生物工程研究所)；PVDF膜生產(chǎn)廠家(美國(guó)Gelman)。

1.4 儀器

血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)；電泳儀(北京六一廠生物工程有限公司)；電熱恒溫干燥箱(上海一橫有限公司)；超低溫冰箱(日本三洋公司)；透射電鏡(1220)(Olympus公司)；組織切片機(jī)(2135)(德國(guó)萊卡)；多功能酶標(biāo)儀(Anth.s 2010)(美國(guó))；cimas Med6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司)；離心機(jī)(LDZ 5-2)(雷勃爾儀器有限公司)；紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)；γ-放免計(jì)數(shù)器(中佳公司)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料

圖1 各組大鼠電鏡下微血管基底膜

普通飼料由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn)加工。高糖高脂飲食飼料配置：在常規(guī)普通飼料的基礎(chǔ)上混合加入10%白砂糖、10%蛋黃粉、2%膽固醇和13%豬油，每周一次由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心加工成顆粒。

2.2 造模及分組

隨機(jī)選擇10只Wistar大鼠作為空白組，給予常規(guī)普通飼料喂養(yǎng)；70只Wistar大鼠高脂高糖飼料連續(xù)喂養(yǎng)8周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素進(jìn)行糖尿病造模(鏈脲佐菌素給藥劑量：30mg/kg)，72小時(shí)后檢測(cè)尾靜脈血糖，篩選隨機(jī)、連續(xù)2次以上血糖≥16.7mmol/L做為糖尿病模型大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn)，篩選符合上述標(biāo)準(zhǔn)的糖尿病大鼠繼續(xù)給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)12周，誘導(dǎo)糖尿病大鼠形成微血管病變。

篩選符合成模標(biāo)準(zhǔn)大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、洋參御糖方高、低劑量組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。各組大鼠均自由進(jìn)行攝食和飲水，藥物灌胃4周后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)和組織取材。

2.3 給藥方法

參照《人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表》確定各組大鼠藥物的給藥劑量如下：二甲雙胍組給藥劑量70mg/kg/d；洋參御糖方高劑量組26.8g/kg/d：洋參御糖方低劑量組6.7g/kg/d；空白組大鼠每日同等量蒸餾水；模型組大鼠予同等量蒸餾水，各組大鼠每日固定時(shí)間灌服相應(yīng)藥物，療程四周。

2.4 標(biāo)本采集

灌胃四周后次日清晨空腹進(jìn)行標(biāo)本采集，尾靜脈采血測(cè)血糖，去眼球收集全血4mL，3000轉(zhuǎn)/分離心5min，分離保存血清備檢血清胰島素；烏拉坦麻醉狀態(tài)下，開(kāi)胸，暴露心臟，剪斷主動(dòng)脈，迅速取出整個(gè)心臟，置于冰袋上，剪去心房和血管，保留左心室心肌，分離切割成1mm×1mm×3mm組織塊，戊二醛溶液固定，以備電鏡檢測(cè)；左心室分割成2mm×2mm×2mm心肌塊，分裝凍存管并標(biāo)號(hào)，置于液氮內(nèi)轉(zhuǎn)移到-80攝氏度冰箱內(nèi)，以備western blot指標(biāo)檢測(cè)。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

全自動(dòng)生化儀測(cè)定各組大鼠空腹血糖；放免法測(cè)定血清胰島素；計(jì)算穩(wěn)態(tài)胰島素抵抗指數(shù)：HOMA-IR=空腹血糖(FPG)×空腹血清胰島素(Fins)/22.5；電鏡觀察心肌微血管基底膜厚度；western blot檢測(cè)VEGFR-1和eNOS蛋白。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用(±s)表示，各組大鼠組間比較滿足方差齊性時(shí)采用方差分析，方差不齊則用T檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 洋參御糖方對(duì)DM大鼠糖代謝及胰島素敏感性的影響

模型組大鼠血糖、血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)較空白組顯著升高(P＜0.05)；二甲雙胍組大鼠以及洋參御糖方高劑量組和洋參御糖方低劑量組均不同程度降低大鼠血糖、血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)，與模型組相比差異顯著(P＜0.05)；二甲雙胍組在降低血糖、血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)方面的作用較洋參御糖方組明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 洋參御糖方對(duì)糖尿病大鼠糖代謝及胰島素敏感性的影響

3.2 洋參御糖方對(duì)DM大鼠心肌微血管基底膜厚度的影響

模型組大鼠微血管基底膜厚度明顯增加(P＜0.05)，二甲雙胍組以及洋參御糖方高劑量組大鼠心肌微血管基底膜厚度與模型組比較有不同程度降低(P＜0.05)，洋參御糖方低劑量組大鼠心肌微血管基底膜厚度和模型組大鼠比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 洋參御糖方對(duì)糖尿病大鼠心肌微血管基底膜厚度的影響

3.3 洋參御糖方對(duì)DM大鼠心肌VEGFR-1及eNOS蛋白表達(dá)的影響

模型組大鼠心肌VEGFR-1蛋白表達(dá)增多，與空白組比較差異顯著(P＜0.05)。二甲雙胍和洋參御糖方高劑量組大鼠心肌VEGFR-1蛋白表達(dá)量較模型組顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。洋參御糖方低劑量組VEGFR-1蛋白表達(dá)量與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

模型組大鼠心肌糖基化終末產(chǎn)物積聚增多，內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白表達(dá)較空白組減少(P＜0.05)，二甲雙胍及洋參御糖方高劑量組大鼠心肌內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白表達(dá)較模型組顯著增加(P＜0.05)，洋參御糖方低劑量組與模型組比較無(wú)明顯差異(P＞0.05)。

圖2 各組大鼠心肌VEGFR-1和eNOS蛋白表達(dá)

4 討論

糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，是一組不斷進(jìn)展的慢性代謝性疾病。綜合歷代醫(yī)家論述和證型研究，認(rèn)為“氣陰兩虛，肝腎不足，瘀血阻絡(luò)”是其基本病機(jī)[5-6]，前期臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明針對(duì)此病機(jī)，應(yīng)用具有益氣補(bǔ)腎、滋陰生津、活血通絡(luò)功效的洋參御糖方治療糖尿病心肌病微血管并發(fā)癥安全有效[7]。研究結(jié)果表明，洋參御糖方能夠降糖、改善胰島素敏感性、抑制基底膜增厚，說(shuō)明其降糖及改善微血管病變的作用；抑制VEGFR-1蛋白表達(dá)，改善VEGF與受體間的平衡關(guān)系，抑制病理狀態(tài)下的新生血管增加，保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能正常；另外，上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮源性一氧化氮的產(chǎn)生與釋放，改善微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，同時(shí)有助于促進(jìn)新生血管形成?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究亦證明，洋參御糖方中部分藥物及藥物有效成分均有降糖、改善胰島素敏感性、改善心肌缺血作用、抗氧化及改善內(nèi)皮細(xì)胞功能作用[8-12]。綜上，洋參御糖方具有調(diào)節(jié)糖代謝、改善微血管結(jié)構(gòu)的作用，可能通過(guò)抑制VEGFR-1蛋白表達(dá)以及上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白表達(dá)保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而改善糖尿病心肌微血管病變。