生乳中L-羥脯氨酸含量測定的不確定度評定

李 均，盧 琳，魏 磊

（新疆獸藥飼料監(jiān)察所，烏魯木齊 830063）

測量不確定度是用以表征合理賦予被測量的值的分散性，是測量結(jié)果含有的一個(gè)參數(shù)。在實(shí)際測量過程中，由于測量工具或是測量中各個(gè)因素的干擾，測得的結(jié)果是以一定的概率分散在某個(gè)區(qū)域內(nèi)的多個(gè)值，測量不確定度是說明被測量之值分散性的參數(shù)。因此在測量的完整表示中應(yīng)包含測量不確定度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的需要，我們對生乳中L-羥脯氨酸的含量測定進(jìn)行了測量不確定度的評定。

1 試驗(yàn)方法及步驟

1.1 稱量及水解

準(zhǔn)確吸取均勻的生乳樣品5.00 mL 于水解管中，加入5.00 mL濃鹽酸（優(yōu)級純）搖勻密封后，置于110 ℃恒溫干燥箱中水解12 h。

1.2 轉(zhuǎn)移定容

打開水解管，用濾紙過濾到100 mL 容量瓶中，用蒸餾水反復(fù)沖洗后定容。

1.3 調(diào)節(jié)pH

精密量取上述樣品溶液10.00 mL 置三角瓶中，用濃度為10 mol·L-1和1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至8±0.2，用水轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中，搖勻，作為供試品溶液待測。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

精密稱取L-羥脯氨酸對照品50 mg（稱準(zhǔn)至0.000 01 g），用0.02 mol·L-1鹽酸溶解并定容至100 mL，得標(biāo)準(zhǔn)儲備液。吸取該標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.00 mL于100 mL 容量瓶中，用0.02 mol·L-1鹽酸溶解并定容至刻度，得標(biāo)準(zhǔn)工作液。然后準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)工作液1.00、2.00、4.00、10.00 和20.00 mL 分別置于100 mL 容量瓶中，用水定容，搖勻，得到濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50 和1.00 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 顯色及測定

分別吸取各濃度下的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和供試品待測溶液各5.00 mL，分別置于25 mL 具塞比色管中，加入氯胺T 溶液2.00 mL，搖勻后于室溫放置20 min，再加入顯色劑2.00 mL，搖勻，蓋上塞子于60 ℃恒溫水浴鍋中加熱20 min 后取出，迅速冷卻，用紫外分光光度計(jì)在560 nm 波長處測定吸光度值，并以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 數(shù)學(xué)模型

樣品中L-羥脯氨酸的含量以質(zhì)量濃度X計(jì)（mg·L-1），按下式計(jì)算：

其中，c：從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的濃度（mg·L-1）；V1：吸取樣品的體積（mL）；V2：樣品水解后的定容體積（mL）；V3：吸取水解液的體積（mL）；V4：水解液調(diào)完pH后定容的體積（mL）。

3 各分量標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定

3.1 測量重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度（A 類評定：標(biāo)準(zhǔn)差法）

為得到可靠性較高的結(jié)果，進(jìn)行8份樣品的平行測量，所得測量數(shù)據(jù)見表1。

表1 測量重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度mg·L-1

利用上述數(shù)據(jù)，按照貝塞爾公式計(jì)算得單次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

則以平均值作為測量結(jié)果時(shí)的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差，即測量重復(fù)性的相對不確定度為：

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

為制作校準(zhǔn)曲線，本次測量配制了6個(gè)不同濃度 的 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液c0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg·L-1，對應(yīng)的吸光度A分別為0.003、0.028、0.055、0.102、0.219和0.427。

用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，得標(biāo)準(zhǔn)曲線1次方程為：A-A0=0.4189c+0.0098，其相關(guān)系數(shù)r=0.9995。

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由于擬合直線本身具有不穩(wěn)定性，用擬合直線計(jì)算樣品中L-羥脯氨酸的含量所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按下式計(jì)算：

其中：p-試樣平行測量次數(shù)；n-擬合直線的數(shù)據(jù)對總數(shù)；s(y)-單次測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差；b-擬合曲線的截距；y-試樣測量響應(yīng)值（p個(gè)）的平均值；yˉ-繪制曲線響應(yīng)值（n個(gè)）的平均值；Ci-繪制曲線用某標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度值；Cˉ-繪制曲線用某標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度輸入值（n個(gè)）的平均值；Cs-從曲線上測得的樣品中L-羥脯氨酸含量的平均值。

p=2，n=12，b=0.4189，yˉ=0.139，C=0.142，將這些數(shù)據(jù)代入公式（2）計(jì)算得到由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：u(Cs)=0.631 mg·L-1。其相對不確定度為：

3.3 紫外分光光度計(jì)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

紫外分光光度計(jì)檢定證書上說明在400～700 nm（由于本次測量波長為560 nm）范圍校準(zhǔn)的最大允許誤差為0.55%，其包含因子k=2，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.4 吸取樣品的移液管相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

用5 mL的單標(biāo)線吸管吸取5.00 mL(v1)，根據(jù)檢定規(guī)程JJG-196-2009中的《常規(guī)玻璃量具》說明，5 mL A級單標(biāo)線吸管的允許誤差為±0.015mL，同樣假定為三角形分布，其包含因子k=，則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.5 定容體積測量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

吸取試樣水解后，轉(zhuǎn)移至100 mL(v2)A 級容量瓶中定容，根據(jù)檢定規(guī)程JJG-196-2009中的《常規(guī)玻璃量具》說明，100 mL A 級容量瓶的允許誤差為±0.10 mL，假定為三角形分布，其包含因子k=，則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.6 分取體積的移液管相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

用10 mL的單標(biāo)線吸管吸取10.00 mL(v3)，根據(jù)檢定規(guī)程JJG-196-2009 中的《常規(guī)玻璃量具》說明，10 mL A級單標(biāo)線吸管的允許誤差為±0.020 mL，同樣假定為三角形分布，其包含因子k=，則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4 合成不確定度

將各分量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度匯總于表2。

表2 輸入量及其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

計(jì)算氟苯尼考含量X的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

5 擴(kuò)展不確定度

取擴(kuò)展銀子k=2，得擴(kuò)展不確定度為：

6 測量不確定度報(bào)告

測定結(jié)果：含量（mg·L-1）=5.79±1.308（±符號后為擴(kuò)展不確定度，k=2，p=95%）。

7 討論與結(jié)論

本文對生乳中L-羥脯氨酸的含量測定進(jìn)行測量不確定度的評定，對6個(gè)影響分量計(jì)算各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，得到合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.654（mg·L-1），算出本試驗(yàn)的擴(kuò)展不確定度為1.308（mg·L-1）。通過評定不確定度，了解檢測過程中的各影響因素，以減少其在試驗(yàn)過程中的影響。

其次，當(dāng)檢測結(jié)果處于檢測邊緣的時(shí)候，不同檢測單位檢測結(jié)果會存在一定的偏差，由于檢測結(jié)果處于臨近狀態(tài)，使檢測結(jié)果超出檢測標(biāo)準(zhǔn)要求。如果進(jìn)行檢測結(jié)果不確定度的評定，給出不確定度值就可避免一些不必要的誤差。最后，開展好測量不確定度的評定，是實(shí)驗(yàn)室提高出具檢驗(yàn)結(jié)果可靠性的重要保障，也是實(shí)驗(yàn)室科學(xué)性、準(zhǔn)確性和專業(yè)技術(shù)水平的體現(xiàn)。