高效液相色譜測定甲酸鹽中的甲酸

萬 宇，譚子璇，嚴欣茹，吳 兵

（四川吉隆達生物科技集團有限公司，四川 廣漢 618300）

抗生素應用于畜牧養殖業的歷史可追溯到20世紀40 年代，抗生素能有效防治動物疾病，提高動物生產性能，大幅提高養殖效益，使畜禽的大規模工廠化養殖成為可能。然而，隨著人類對抗生素認識的不斷加深，抗生素所產生的副作用也越來越受到關注。近年來，抗生素的濫用問題給人類帶來了巨大的困擾：抗生素使用不當，會導致細菌產生耐藥性，產生超級細菌；抗生素的濫用，會造成藥物殘留超標，導致動物免疫力下降，嚴重影響動物源性食品安全；抗生素作為飼料添加劑使用，給人類健康和生態系統帶來了明顯危害。歐盟早在2006 年就已全面禁止抗生素作為飼料添加劑使用，美國也于2017 年開始禁止在飼料中使用預防性抗生素。在飼料中禁止添加抗生素已是大勢所趨，為維護我國動物源性食品安全和公共衛生安全，農業農村部發布第194 號公告，禁用促生長類藥物飼料添加劑。飼料禁抗迫在眉睫，酸化劑是目前主流的替抗選擇。酸化劑當中，甲酸因具有良好的抑菌效果受到人們的關注。甲酸又名蟻酸，分子式為HCOOH，相對分子質量46.03。甲酸是一種小分子有機酸，對大腸桿菌和沙門氏菌等微生物有一定的抑制作用，但是由于甲酸有較大的刺激氣味且腐蝕性強，限制了甲酸在飼料中的應用，而具有穩定性質和較強緩沖能力的甲酸鹽更適宜于飼料加工。甲酸鹽的物理性質穩定，不易吸潮，流動性好，pH 接近中性，不會造成生產設備的腐蝕，利于飼料加工。在動物體內，甲酸鹽是動物組織和血液的天然成分，合理添加不會對動物的健康造成危害。甲酸鹽可以在酸性條件下游離出甲酸，能有效降低胃腸道的pH，且具有緩沖功效，有利于胃腸道pH 的穩定，抑制有害細菌的繁殖，促進有益微生物的生長，防止和減少仔豬腹瀉、下痢等現象的發生，提高飼料的消化吸收率。甲酸鈣在飼料中的應用較早，1998年，農業部發布了14 類飼料添加劑，甲酸鈣位列其中。試驗表明，在仔豬斷奶后幾周的飼料中添加甲酸鈣可以提高仔豬生長速率，提高飼料轉化率，并減少仔豬的發病率。同時，甲酸鈣還有防霉保鮮的功效，在青貯飼料中添加甲酸鈣，可提高乳酸的含量，抑制丁酸的產生，增加青貯飼料的營養成分和風味。二甲酸鉀是一種有機酸鹽，分子式為HCOOH·HCOOK，是由甲酸鉀和甲酸分子通過氫鍵結合而成的二聚體，相對分子質量為130.14，在酸性條件下穩定，在堿性條件下分解為甲酸和甲酸鉀。二甲酸鉀是歐盟批準的第一種用于替代抗生素促生長的非抗生素飼料添加劑，我國于2005 年批準其作為飼料添加劑。字正浩研究表明，在仔豬基礎日糧中，添加二甲酸鉀可以提高飼料利用率，提高斷奶仔豬的生長性能和健康水平；和復合抗生素相比，在減少腸道內容物腸桿菌數量的同時，不會抑制胃腸道內容物中乳酸桿菌數量[1]。林文爽研究表明，二甲酸鉀具有良好的防霉效果，與甲酸防霉性能相當，且比甲酸更適合用于飼料添加劑[2]。可在替代抗生素促生長的同時，替代常用飼料防霉劑，降低飼料生產成本。銅、鐵等金屬離子催化自由基反應的能力很強并能催化電子傳遞反應，對飼料和預混料中的維生素有破壞作用，造成維生素的損失。甲酸鹽為絡合物，金屬離子與甲酸通過配位健結合，不易電離，比硫酸鹽等無機鹽產生更少的金屬離子。趙金偉研究了甲酸鹽（鐵、鋅、銅）及硫酸錳組合效應對維生素穩定性的影響，結果表明，甲酸亞鐵、甲酸鋅及甲酸銅的組合與硫酸亞鐵、硫酸鋅及硫酸銅的組合相比，可減少預混料中維生素A和煙酰胺的損失[3]。

目前，測定甲酸的方法常用的有氧化還原滴定法、離子色譜法、高效液相色譜法和氣相色譜法[4-10]。其中，氧化還原滴定法是通過高錳酸鉀與甲酸定量反應，過量的高錳酸鉀在酸性條件下，將碘化鉀氧化成單質碘，析出的碘用硫代硫酸鈉標準滴定溶液滴定，間接法測定甲酸含量，很多有還原性的雜質會對檢測結果造成干擾。氧化還原滴定法常用于鉆井液中甲酸鉀和甲酸鈉的測定，在甲酸鈣、二甲酸鉀等金屬價態穩定的甲酸鹽中可以推廣使用，但不適用于變價金屬鹽（銅、鐵、錳等）中甲酸含量的測定；氣相色譜需要將甲酸轉化成衍生物，操作較繁瑣，硅膠管的解析效率不穩定，檢測結果相對偏差較大。離子色譜和高效液相色譜法檢測甲酸含量是普遍使用的方法，離子色譜通過純水提取甲酸根離子，并經固相萃取柱凈化，以氫氧化鉀溶液淋洗，陰離子交換柱分離，電導檢測器檢測；和離子色譜相比，高效液相色譜儀的普及率更高，本文采用高效液相色譜法檢測甲酸鹽（銅、錳、鋅、亞鐵）中甲酸的含量。甲酸是一種酸性較強的有機酸，pKa 為3.745，在水中有很大的電離，大部分以離子形式存在，在色譜柱上保留較少，故常采用抑制電離的方法將甲酸轉化為分子形式在色譜柱上保留。

目前，甲酸的高效液相色譜測定多使用磷酸及其鹽作流動相，鄭婷等使用流動相為0.1 mol·L-1磷酸二氫鈉緩沖溶液:乙腈=98:2，磷酸調節pH=2[11]；黃志英等采用的流動相為乙腈+0.02%磷酸溶液（5+95，v/v）[12]；雷萍等用0.404 g 庚烷磺酸鈉用純水溶解后，加入0.2 mL磷酸，定容至1 L配制成緩沖液，緩沖液:乙腈=90:10[13]。磷酸及其鹽在有機酸的檢測中應用比較廣泛，但和很多金屬離子易產生不溶物，會對設備和檢測結果造成影響，樣品不能直接進樣，需進行前處理，操作比較繁瑣，且容易產生損耗、影響檢測精度。本文采用稀硫酸溶液作為流動相，操作簡捷，同時避免了由于化學沉淀所引起的測定誤差。

1 試驗材料

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（WUFENG LC-UV100 plus）；分析天平（感量為0.0001 g）；超聲波清洗器；微孔濾膜（孔徑0.45 μm）；甲酸（標準品）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；硫酸（分析純）；水（超純水）；甲酸銅（自制）；甲酸鋅（自制）；甲酸錳（自制）；甲酸亞鐵（自制）。

1.2 色譜及檢測條件

色譜柱：C18柱，長250 mm，內徑4.6 mm，粒度5 μm（極性色譜柱）；柱溫：30 ℃；流動相：0.0275%硫酸溶液；流速：1 mL·min-1；檢測波長：206 nm；進樣量：20 μL。

2 方法與結果

2.1 pH的選擇

考慮到一般色譜柱的耐酸能力，使用流動相的pH 范圍2≤pH≤9，根據甲酸的電離常數，流動相的pH選擇2.5，即硫酸溶液的濃度為0.0275%。由于未添加緩沖物質，試樣直接用水定容容易造成pH不穩定，導致出現負峰，見圖1。經試驗，試樣溶液用流動相溶解并定容能夠消除pH 不穩定造成的影響，不需添加緩沖物質，增加操作步驟。

圖1 甲酸亞鐵樣品色譜（未用流動相定容）

2.2 溶劑和波長的選擇

甲醇的截止波長為205 nm，乙腈的截止波長為190 nm，甲酸在206 nm 處有最大吸收。為避免干擾，波長選用210 nm 進行試驗。流動相中分別添加5%的甲醇和乙腈進樣，結果表明添加甲醇和乙腈均會對檢測結果造成干擾。減小甲醇和乙腈的比例，仍有不同程度的干擾。甲酸的極性較強，保留時間靠前，不需要加入有機相進行調整，波長調整至206 nm，甲酸有更好的吸收。不同的金屬離子在甲酸出峰前均有不同程度的峰響應，加入甲醇和乙腈均使甲酸出峰時間前移，不利于峰分離，故本文流動相中未添加。

2.3 標準工作液的制備

稱取甲酸標準品適量，配制成20 mg·mL-1的甲酸標準溶液。準確吸取1、2、3、4、5 mL 標準溶液于100 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，混勻。得到濃度分別為200、400、600、800、1 000 μg·mL-1的標準工作液。

圖2 甲酸標準樣品色譜

2.4 試樣溶液的制備

稱取試樣約0.1 g（精確至0.000 1 g），用流動相溶解并定容于100 mL 容量瓶中，搖勻。取部分溶液過0.45 μm濾膜，濾液作為試樣溶液。

2.5 線性關系分析

分別取標準工作液（2.3）和試樣溶液（2.4），按（1.2）列出的條件進行液相色譜分析測定。甲酸標準品色譜圖見圖2。測定中應調整試樣溶液的濃度，使甲酸濃度落在標準曲線的相應范圍內。

標準工作液濃度由低至高進行進樣，以標準品色譜峰峰面積為縱坐標（Y），標準品濃度（μg·mL-1）為橫坐標（X），作線性回歸方程：

R2=0.9999，Y=1.3444X-11.323

2.6 精密度試驗

取同1 份樣品，相同體積20 μL，重復進樣6次平行測定（n=6），結果見表1。

表1 精密度試驗結果

2.7 重復性試驗

取同一樣品（甲酸鋅Zn-2020050503），按試樣溶液制備方法平行制備6份測定。甲酸含量平均值為47.48%，RSD為0.6%。甲酸鋅樣品色譜見圖3。

2.8 加樣回收率試驗

準確吸取已知濃度的樣品加入一定量的標準工作溶液，按照試樣溶液方法制備試樣溶液，測定結果平均回收率為98.8%，RSD為0.8%。

圖3 甲酸鋅樣品色譜

表2 不同甲酸鹽樣品的測定

2.9 樣品測定

分別取不同批次的甲酸鹽樣品，按照試樣溶液方法制備，分別進樣測定，結果見表2（n=3）。甲酸銅、甲酸錳、甲酸亞鐵樣品色譜分別見圖4～圖6。

結果表明，按照本文方法對不同的甲酸鹽樣品進行測定，相對標準偏差為-0.5%～0.3%，峰型良好，干擾小，準確度高。

圖4 甲酸銅樣品色譜

圖5 甲酸錳樣品色譜

圖6 甲酸亞鐵樣品色譜

3 討論與分析

本文為簡化操作步驟，流動相未添加緩沖物質，樣品處理時直接用流動相溶解并定容。從結果看，峰型穩定，分離度好，無干擾。但本文僅選取了部分具有代表性的甲酸鹽進行試驗，不能代表所有甲酸鹽的性質，且不同儀器設備的性能可能存在差異。若仍出現pH 不穩定的情況，可考慮加入適量硫酸銨進行調節，通過銨鹽的緩沖增強穩定性，但高濃度的硫酸-硫酸銨體系可能會對色譜柱和泵產生一定的影響。

樣品用流動相溶解有利于保持試樣溶液的穩定性。甲酸鹽基本呈中性，亞鐵離子、二價錳離子有較強的還原性，亞鐵離子在pH＞5時，極易氧化成三價鐵，三價鐵溶解度極低，易沉淀析出；二價錳離子在中性或堿性條件下也易氧化成四價錳，形成二氧化錳析出。沉淀的產生會對檢測結果產生干擾，流動相定容使樣品溶液呈酸性，避免氧化。對比圖1和圖2可以看出，試驗溶液pH的降低同時增大了金屬離子的電離，金屬離子的峰響應明顯降低，降低了對甲酸檢測的干擾。

該方法可以推廣到大部分甲酸鹽的檢測，部分與硫酸根易產生沉淀的金屬離子（如鋇離子、銀離子等）不適用于該方法。

4 結 論

目前，甲酸鈣和二甲酸鉀已在飼料中大量使用，甲酸銅、鋅、鐵等在飼料中可作為硫酸鹽的替代品，有潛在應用價值，但我國均無相應的國家或行業質量標準，其生產都是參照企業標準執行。各企業采用的生產工藝不同，部分企業副產甲酸鹽，產品中可能會帶入部分雜質，導致產品的質量狀況差異較大，不利于甲酸行業的發展。與其他有機酸相比，甲酸價格便宜，抑菌效果好，是飼料替抗的主流選擇之一，在飼料中有良好的應用前景。利用高效液相色譜法檢測甲酸鹽中的甲酸，方法簡捷，檢測結果可信度高，能夠實現甲酸的定性定量檢測，為甲酸鹽的質量評估提供參考。