阿拉伯呋喃糖苷酶的重組表達及其發酵工藝優化

李鴻雁，陸健，李曉敏*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 4(江蘇省生物活性制品加工工程技術研究中心，江蘇 無錫，214122)

阿拉伯木聚糖(arabinoxylan)是谷物中最主要的非淀粉多糖[1]，基本結構是以β-1,4糖苷鍵連接的D-吡喃木糖線型主鏈，通過C(O)-2、C(O)-3或C(O)-2,3糖苷鍵連接α-L-阿拉伯呋喃糖基取代物，側鏈C(O)-5位上存在以酯鍵相連的阿魏酸[2]。在大米和高粱中阿拉伯木聚糖結構相對簡單，而在大麥、小麥、燕麥、黑小麥、玉米等谷物中相對復雜。阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)可以特異性水解阿拉伯木聚糖側鏈上的α-1,2、α-1,3和α-1,5糖苷鍵[3]，從而協同木聚糖酶促進阿拉伯木聚糖水解為寡糖。阿拉伯呋喃糖苷酶被歸類于糖基水解酶GH3、GH43、GH51、GH54和GH62家族[5]，不同家族水解酶表現出不同的底物特異性，如GH43家族成員傾向于水解寡糖中的側鏈，GH51和GH54家族成員可水解阿拉伯聚糖和木聚糖的側鏈，僅GH62家族成員特異性水解阿拉伯木聚糖側鏈[6]。其中來源于草酸青霉菌(Penicilliumoxalicumsp.68)的阿拉伯呋喃糖苷酶PoAbf62A即屬于GH62家族，且研究表明，PoAbf62A僅有α-1,3-阿拉伯呋喃糖苷酶活性[7]，具有特殊的研究和應用價值。

目前，已有利用酵母、大腸桿菌、芽孢桿菌等表達宿主進行阿拉伯呋喃糖苷酶的重組表達的研究[8-10]。相較于其他系統，畢赤酵母具有能夠將外源基因穩定地同源重組至基因組；胞外分泌蛋白種類少，易于分離純化目的蛋白；便于高密度發酵等優勢[11]。因此，本研究選取畢赤酵母GS115重組表達PoAbf62A，并對酶學性質進行研究，優化重組菌株的發酵條件，為糖苷水解酶家族的研究提供參考，并為開發以阿拉伯木聚糖為代表的半纖維素資源利用的新方法提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α，畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115和pPIC9K質粒，本實驗室保存。

1.1.2 試劑

限制性內切酶SalⅠ、NotⅠ和EcoRⅠ、rTaq酶、質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒，TaKaRa公司；對硝基苯-α-L-阿拉伯呋喃糖苷(p-nitrobenzene-L-arabinofuranoside，pNPAF)、抗生素G418，上海索萊寶生物科技有限公司；低分子質量標準蛋白Marker，BBI生命科學有限公司。

1.1.3 培養基

YPD培養基(g/L)：酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20；

MD固體培養基(g/L)：葡萄糖20，YNB (無氨基酵母氮源)13.4，生物素0.000 4，瓊脂20；

BMGY培養基(g/L)：酵母提取物10，蛋白胨20，YNB 13.4，甘油的體積分數為1.0%，1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0),體積分數為10%；

BMMY培養基(g/L)：酵母提取物10，蛋白胨20，YNB 13.4，甲醇的體積分數為1.0%，1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0),體積分數為10%。

1.1.4 主要儀器

瓊脂糖凝膠電泳儀，美國Bio-Rad公司；JD-801凝膠成像儀，江蘇省捷達科技發展有限公司；Spectra Max Plus 384酶標儀，美國MDC公司；HisTrapTMexcel (1 mL)色譜柱，GE Healthcare公司；Mastercycler pro PCR儀，德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1poabf62a基因的克隆和重組表達

參照GenBank中poabf62a基因序列(GenBank ID：MG874674)，設計重組蛋白序列：根據畢赤酵母密碼子偏好性優化poabf62a序列，在其3’端添加His-tag序列，并在其5’和3’端分別添加NotⅠ和EcoR I酶切位點和保護堿基，由金唯智生物科技(蘇州)有限公司合成，獲得的基因片段經NotⅠ和EcoR I雙酶切后，與表達載體pPIC9K連接，獲得重組表達質粒pPIC9K-poabf62a，轉化至大腸桿菌DH5α，測序正確后備用。

表達質粒pPIC9K-poabf62a經SalⅠ酶切線性化后電轉入畢赤酵母GS115感受態細胞中，涂布于含有G418的MD平板篩選轉化子，30 ℃培養48 h；待長出菌落后，隨機挑取轉化子于3 mL YPD培養基中，30 ℃培養36 h，提取基因組作為PCR模板鑒定陽性轉化子，所用上下游引物序列為GAGGTCTCCTATCTCTAACTTGGACC/TGGTGGTGATGGTGGTG-CTT。

挑取陽性轉化子單克隆至50 mL BMGY培養基，30 ℃培養24 h后8 000 r/min離心5 min收集菌體，加入50 mL BMMY培養基，每24 h加入500 μL甲醇，30 ℃培養5 d誘導目的基因表達，8 000 r/min離心5 min收集上清液，SDS-PAGE電泳檢測重組酶，篩選表達量較高的轉化子。

將篩選獲得的重組酶表達量最高的轉化子接種于50 mL BMGY培養基，30 ℃培養24 h后，8 000 r/min離心5 min，收集菌體重懸于50 mL BMMY培養基，進行甲醇誘導，甲醇初始體積分數為1.0%，每24 h補加500 μL甲醇進行持續誘導，5 d后于8 000 r/min離心5 min收集上清液，利用Ni-NTA鎳親和層析柱純化重組阿拉伯呋喃糖苷酶，利用SDS-PAGE檢測純度。

1.2.2 重組PoAbf62A的酶活力測定

參照HU等[7]的方法，以pNPAF為底物檢測酶活力，標準反應體系200 μL，其中含150 μL 20 mmol/L pH 4.5醋酸鈉緩沖液，25 μL 0.5 mg/mLpNPAF，純化的酶液25 μL；空白對照中含有等量沸水浴滅活的酶液。37 ℃反應30 min，加入50 μL 0.5 mol/L Na2CO3終止反應，靜置30 min，用酶標儀測定OD405，根據對硝基苯酚標準曲線計算反應體系中對硝基苯酚的生成量。37 ℃下1 mg固體酶(或1 mL液體酶)每1 min釋放1 μmol/L對硝基苯酚所需的酶量定義為1個酶活力單位(U/mg或U/mL)。

1.2.3 重組PoAbf62A的酶學性質研究

1.2.3.1 酶的最適溫度及其熱穩定性

將標準反應體系(見1.2.2)分別于30、35、40、45、50、55和60 ℃水浴反應30 min，測定PoAbf62A酶活力，以其中測得的最高酶活力設為100%。將適量純化后的酶液分別置于40、45和50 ℃恒溫水浴保溫90 min，每間隔15 min取樣1次，于最適反應條件下測定殘余酶活力，以保溫0 min時的酶活力設為100%。

1.2.3.2 酶的最適pH及其pH穩定性

配制20 mmol/L pH 2.5～7.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，分別取150 μL不同pH的緩沖液與25 μL純化的酶液和25 μL 0.5 mg/mLpNPAF混合，37 ℃反應30 min后，測定PoAbf62A酶活力，以其中測得的最高酶活力設為100%。將適量純化后的酶液置于上述不同pH緩沖液中，4 ℃放置24 h后，于最適反應條件下測定其殘余酶活力，其中酶活力最高的設為100%。

1.2.3.3 金屬離子對重組PoAbf62A活性的影響

在標準反應體系(見1.2.2)中加入終濃度為1 mmol/L的金屬離子(K+、Ca2+、Fe2+、Mn2+、Fe3+、Ni2+、Ba2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Cu2+、Al3+)，以不加金屬離子的反應體系作為對照(酶活力設為100%)，測定各金屬離子對PoAbf62A活性的影響。

1.2.3.4 重組PoAbf62A的動力學研究

在標準反應體系(見1.2.2)中加入不同濃度pNPAF (0.16～2.60 mmol/L)，在最適條件下測定酶活力，利用米氏方程雙倒數法(Lineweavere-Burk)作圖并繪制曲線，計算Km、vmax和kcat值。

1.2.4 重組PoAbf62A表達條件優化

1.2.4.1 誘導表達時間

將BMGY培養基中酵母菌離心后，接種至BMMY培養基，使OD600值為1.0，甲醇初始體積分數為1.0%，30 ℃ 250 r/min發酵7 d，每24 h補加甲醇使甲醇的體積分數為1.0%，并取1 mL發酵液離心取上清液，以pNPAF為底物測定發酵液酶活力。

1.2.4.2 誘導溫度

將BMGY培養基中酵母菌離心后，分別接種至BMMY培養基，使OD600值為1.0，甲醇初始體積分數為1.0%，分別置于26、28、30、32和34 ℃恒溫培養箱中，調整轉速為250 r/min，發酵5 d，每24 h補加甲醇使甲醇體積分數為1.0%，發酵結束后，發酵液離心取上清液，以pNPAF為底物測定發酵液酶活力。

1.2.4.3 甲醇誘導體積分數

將BMGY培養基中酵母菌離心后，接種至BMMY培養基，使OD600值為1.0，分別添加甲醇使甲醇的體積分數為0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%，30 ℃ 250 r/min發酵5 d，每24 h補加1次相應體積分數的甲醇，發酵結束后，分別取發酵液離心，以pNPAF為底物測定發酵液酶活力。

1.2.4.4 BMMY培養基的接種量

將含有pPIC9K-poabf62a的轉化子在BMGY培養基中擴大培養至對數生長期(30 ℃培養24 h)，8 000 r/min離心收集菌體，接種至BMMY培養基，使菌體濃度(OD600)分別為1.0、3.0、5.0、7.0和9.0，甲醇初始體積分數為1.0%，30 ℃ 250 r/min發酵5 d，每24 h補加甲醇使甲醇的體積分數為1.0%并進行持續誘導，發酵結束后，發酵液離心取上清液，以pNPAF為底物測定發酵液酶活力。

1.2.4.5 響應面試驗

根據以上單因素試驗結果，選出3個顯著性較明顯的因素：甲醇體積分數(A)、溫度(B)、接種量OD600(C)3個因素為自變量，發酵液酶活力為因變量，利用Design Expert 8.0.6軟件設計Box-Behnken實驗，確定最佳發酵工藝參數組合并進行驗證。

2 結果與分析

2.1 PoAbf62A的克隆和表達純化

GenBank數據庫中poabf62a基因全長996 bp，編碼332個氨基酸殘基，預測蛋白分子質量為33 kDa。根據畢赤酵母密碼子偏好性，優化poabf62a序列，通過化學合成方法合成優化的poabf62a基因，并在3’端添加His-tag序列，在其5’和3’端分別加入限制性酶切位點和保護堿基，以構建pPIC9K-poabf62a表達質粒。pPIC9K-poabf62a線性化后電轉化至畢赤酵母GS115，經PCR驗證(圖1-a)及表達量篩選(圖1-b)，挑選表達量最高的陽性轉化子表達重組酶，并利用Ni-NTA鎳親和層析柱分離純化，SDS-PAGE電泳顯示重組酶分子質量與預測結果基本一致(圖1-c)。

a-PCR鑒定；b-篩選；c-純化蛋白a：M-15 000 bp Marker;1-質粒為模板的PCR;2-重組菌株基因組為模板的PCR；b：M-標準蛋白Marker，1、2-轉化子發酵上清液；c：M-標準蛋白Marker；1-純化的酶液圖1 重組子的PCR鑒定和篩選及純化蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig.1 Identification and screening of recombinantsand the purified PoAbf62A in SDS-PAGE

2.2 重組PoAbf62A的酶學性質

2.2.1 重組PoAbf62A的最適反應溫度和pH

不同反應溫度下測定重組PoAbf62A的酶活力，結果表明，重組酶最適反應溫度為40 ℃，當反應溫度在30～45 ℃時，相對酶活力>80%；當反應溫度為50 ℃，相對酶活力約為50%；當反應溫度>55 ℃，相對酶活力<20% (圖2-a)。在不同pH緩沖液(pH 2.5～7.0)下測定重組PoAbf62A的酶活力，結果表明,重組酶的最適pH值為4.5，在pH 4.0～5.0的范圍內相對酶活力均在80%左右；在pH 5.5時相對酶活力約為40%；緩沖液pH<4.0或>6.0，相對酶活力<40% (圖2-b)。

a-溫度;b-pH圖2 溫度和pH對重組PoAbf62A活力的影響Fig.2 Effects of temperature and pH on the activity ofrecombinant PoAbf62A

將適量酶液分別在40、45、50 ℃溫度下恒溫水浴90 min，每間隔15 min取酶液于最適反應條件下測定殘余酶活力，將保溫0 min時的酶活力設為100%。由圖3-a可知，該酶在40、45、50 ℃條件下較穩定，其中40 ℃時最穩定，90 min后酶活力仍保留初始酶活力的50%左右，45 ℃和50 ℃為其次，90 min后分別能剩余20%左右的酶活力。

取適量酶液分別置于pH 2.5～7.0的緩沖液中，4 ℃放置24 h，于最適反應條件下測定殘余酶活力，其中酶活力最高的設為100%。由圖3-b可知，重組酶在pH 4.5比較穩定，處理24 h酶活力最高；在pH 5.0～7.0條件下處理24 h后，殘余酶活力為20%左右；在pH 2.5～4.0條件下處理24 h后，基本喪失活性。

a-溫度;b-pH圖3 溫度和pH對重組PoAbf62A穩定性的影響Fig.3 Effects of temperature and pH on the stability ofrecombinant PoAbf62A

2.2.2 金屬離子對重組PoAbf62A活性的影響

在以終濃度為1 mmol/L金屬離子的標準體系(見1.2.2)中反應測量純化后重組PoAbf62A酶活力， Fe3+、Mn2+、Cu2+和Fe2+對重組PoAbf62A的酶活力有強烈的抑制作用，使其幾乎沒有酶活力；Ni2+和Ba2+對重組PoAbf62A的酶活力有微弱的抑制作用，酶活力分別為對照的90.3%、79.8%；Zn2 +、Co2+、Mg2+和Al3+對重組PoAbf62A的酶活力有不同程度的促進作用；K+、Ca2+對其酶活力幾乎沒有影響(表1)。

表1 金屬離子對重組PoAbf62A酶活力的影響Table 1 Effects of metal ions on the activity ofrecombinant PoAbf62A

2.2.3 重組PoAbf62A的動力學

純化后重組PoAbf62A的酶活力為0.67 U/mg，利用Lineweavere-Burk雙倒數作圖，分別求取以pNPAF為底物，重組PoAbf62A的Km、Vmax和kcat值。所得米氏方程為y=0.271 3x+0.110 5 (R2=0.997)，重組PoAbf62A的動力學常數Km、Vmax和kcat值分別為2.46 mmol/L、9.05 μmol/(min·g)和0.22 s-1。

2.3 重組PoAbf62A的發酵優化

2.3.1 單因素實驗

如圖4-a所示，重組菌株在BMMY培養基中培養到120 h時，發酵液酶活力最高，為0.12 U/mL。因此，本研究將誘導表達重組酶的時間定為120 h。

在不同誘導溫度下發酵，當發酵溫度為30 ℃時發酵液酶活力最高，26和34 ℃時發酵液酶活力分別只有最優發酵溫度時的20%和10%(圖4-b)。當溫度過低時，微生物的代謝緩慢，也不利于營養物質的運輸，而溫度過高時，蛋白質變性降解，因此溫度過高或過低都不利于重組酶的表達。

a-誘導時間；b-誘導溫度;c-甲醇體積分數；d-接種量圖4 誘導時間、誘導溫度、甲醇體積分數和接種量對重組菌株產酶的影響Fig.4 The effects of induction period,temperature,methanol volume fraction and inoculation size on theyield of recombinant PoAbf62A

在BMMY培養基中添加誘導劑甲醇使初始體積分數分別為0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%，且每隔24 h添加1次甲醇，如圖4-c所示，當添加甲醇的體積分數為1.0%時，發酵5 d后發酵液酶活力最高。

比較BMMY培養基中初始菌體濃度(OD600)分別為1.0、3.0、5.0、7.0和9.0時，發酵完成后發酵液酶活力結果如圖4-d所示，當初始OD600值為3.0時，發酵5 d后發酵液酶活力最高。

2.3.2 響應面分析

根據Box-Behnken試驗設計原理，設計了17個實驗的響應分析實驗，以甲醇體積分數(A)、溫度(B)、接種量OD600(C)3個因素為自變量，發酵液酶活力為因變量，實驗設計與結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計與結果Table 2 Box-Behnken test design and results

運用軟件Design-Expert 8.0.6進行回歸分析，獲得二次擬合回歸方程：Y=0.57-0.018A-0.003B-0.006 7C-0.001 3AB-0.038AC-0.003 8BC-0.11A2-0.12B2-0.17C2(R2=0.998 1),對實驗數據進行方差分析模型P>F<0.000 1，失擬項的P>F>0.05表明回歸方程極顯著，該方程為重組菌株發酵產酶提供了一個合適的模型，因此可用此模型代替實際實驗對重組菌株發酵產酶進行分析和預測。根據軟件計算回歸模型存在的最大點為：A=1.05，B=30.49，C=2.36，根據實際情況將參數修改為：A=1.05，B=30.5，C=2.4。即得最佳發酵條件為：添加誘導劑甲醇的體積分數為1.05%，誘導表達溫度為30.5 ℃，BMMY培養基中接種量OD600值為2.4，在此條件下預測發酵液酶活力為0.55 U/mL，實驗實際值為0.51 U/mL，與預測結果基本接近，說明所建模型擬合度良好且可靠。

3 結論與討論

本研究將來源于草酸青霉菌P.oxalicumsp.68的阿拉伯呋喃糖苷酶PoAbf62A在畢赤酵母GS115中重組表達，具有較好的溫度穩定性，對pH較敏感，在40 ℃和pH 4.5的條件下具有最優水解活性。此前報道的來自稻平臍蠕孢、特異腐質霉和青春雙歧桿菌的阿拉伯呋喃糖苷酶，其最適pH值分別為5.0、6.7和6.0，最適溫度分別為50、53和40 ℃[12]，PoAbf62A在酸性環境中表現出更好的活性和穩定性，使得該酶在果汁、酒類等食品加工領域具有更大的優勢。

為了獲得更多的重組酶，本研究結合單因素實驗和響應面分析對發酵誘導條件進行了優化，即BMMY培養基中畢赤酵母工程菌接種量為OD600值為2.4，添加誘導劑甲醇的體積分數為1.05%，且每24 h補加1次，30.5 ℃ 250 r/min誘導120 h，獲得的發酵液中酶活力為0.51 U/mL。以pNPAF為底物測得純化后酶的Km值為2.46 mmol/L，最大反應速度Vmax值為9.05 μmol/(min·g)，kcat值為0.22 s-1。

研究表明，草酸青霉菌P.oxalicumsp.68的阿拉伯呋喃糖苷酶PoAbf62A屬于可特異性水解阿拉伯木聚糖側鏈的GH62水解酶家族[12]，但不同于其他GH62家族成員，該酶僅具有α-1,3-阿拉伯呋喃糖苷酶活性[11]。目前，對GH62家族的阿拉伯呋喃糖苷酶研究顯示，大多數酶僅能降解單取代的阿拉伯糖側鏈[13]，能降解雙取代阿拉伯糖側鏈的阿拉伯呋喃糖苷酶大多來自于GH43家族，但對α-1,2和α-1,3糖苷鍵無選擇性[14]。PoAbf62A對取代阿拉伯糖側鏈和糖苷鍵的特異選擇性，使其在生物技術和多糖結構研究中具有較大的應用潛力。

近年來，隨著能源問題的日益突出，半纖維素資源利用價值逐漸受到人們的重視。半纖維素是由戊碳糖和(或)己碳糖及其衍生物通過糖苷鍵形成的不均一的帶有支鏈的混合聚糖[15]，其最主要的成分是由β-1,4糖苷鍵連接的D-吡喃木糖主鏈及連接了阿拉伯糖、阿魏酸酯基、葡萄糖醛酸、乙酰基等不同取代基的側鏈構成的阿拉伯木聚糖[16]。阿拉伯木聚糖需要多種酶的參與才能完全水解，木聚糖酶、木糖苷酶水解主鏈[17-18]，水解側鏈的輔助酶如阿拉伯呋喃糖苷酶可協助阿拉伯木聚糖的水解，提高阿拉伯木聚糖的降解效率，使底物更徹底地水解，得到阿魏酸、低聚糖阿魏酸酯等產物[19]。研究表明，阿魏酸、低聚糖阿魏酸酯都具有抗氧化、抗輻射、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等生理活性[4,20]，因此，阿拉伯呋喃糖苷酶在水解以阿拉伯木聚糖為原料的生物活性物質制備中具有廣闊的應用前景，對PoAbf62A的研究將為發展阿拉伯木聚糖水解酶復合物制備阿拉伯糖基寡糖提供新的工具，同時為將草酸青霉菌P.oxalicumsp.68應用于其他谷物原材料的再利用提供理論參考。