甜蛋白Brazzein在畢赤酵母中的表達及應用

孟珊珊，譚明，肖冬光，宋詼*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457) 2(中國科學院 天津工業生物技術研究所，天津，300308)

植物甜蛋白是指自然界中存在有甜味或可以引起甜味產生的一種蛋白質，它們大多具有高倍甜度、低熱量且安全無毒的特點，作為蔗糖替代品，不會引起高血壓、高血脂、糖尿病等疾病，在食品和制藥等行業有著潛在的應用價值[1-2]。迄今為止，學者從植物中已分離出7種甜蛋白，包括索馬甜(Thaumatin)、馬檳榔(Mabinlin)、巴西甜蛋白(Brazzein)、莫奈林(Monellin)、奇異果(Miraculin)、培它汀(Pentadin)及仙茅甜蛋白(Curculin)[3-4]。其中Brazzein由于具有良好的溶解性，較好的pH和熱穩定性，是一種具有應用潛力的天然來源的高倍甜味劑[5]。

Brazzein由MING等[6]1994年在非洲西部野生植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon果實中首次分離發現。該蛋白分子由54個氨基酸殘基組成，活性形式為單體，蛋白分子質量為6.5 kDa[7]。分子二級結構包含1個短α-螺旋(殘基21～29)和3個反平行β-折疊(鏈I，殘基5～7；鏈II，殘基44～50；鏈III，殘基34～39)[8-9]。其分子內部還包含4個二硫鍵(Cys4-Cys52、Cys16-Cys37、Cys22-Cys47和Cys26-Cys49)，是其具有良好穩定性的結構基礎。

除了在高倍甜味劑方面的應用外，有研究表明，巴西甜蛋白具有一定的消炎和抗氧化性，且其蛋白序列與抗細菌多肽防御素和胰蛋白酶抑制劑有42%～45%的相似性，與抗菌蛋白1(antimicrobial protein 1)、德羅霉素(drosomycin)、蝎子毒素(scorpion alpha-toxin OD1)、神經毒素(neurotoxin)和植物防御素(plant defensin)等都具有高度相似性[10]。有研究表明，其對于部分細菌和真菌具有一定的抑菌活性[11]。

由于巴西甜蛋白來源于植物，直接提取工藝復雜且產量低，不能滿足市場需求[12]，通過基因工程的手段高效表達外源巴西甜蛋白，并對其性能進行研究和應用開發均具有重要意義。目前已經有研究者將Brazzein基因構建到大腸桿菌表達系統[13]，但是經誘導培養后，表達的巴西甜蛋白以包涵體的形式存在[14-15]，純化后的重組甜蛋白還需要進一步的復性才具有活性[16]。

本研究選用畢赤酵母表達系統對巴西甜蛋白與蛋白二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase，PDI)進行外源共表達；利用超濾-納濾膜分離系統和冷凍干燥技術開發重組Brazzein的低成本制備工藝；對重組Brazzein進行口感評價，并研究其對常見致病菌和腸道益生菌的體外抑菌性能，為其在甜味劑方面的推廣應用提供理論基礎。

1 材料與試劑

1.1 菌株及質粒

大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α、畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115、枯草芽孢桿菌ATCC6633、金黃色葡萄球菌ATCC27217、大腸桿菌ATCC25922、白念珠菌ATCC36082、檜狀靑霉ATCC10519、干酪乳桿菌ATCC334、嗜酸乳桿菌ATCC4356、糞腸球菌ATCC29212及質粒pPIC9K、pPICZA-PDI,均為天津工業生物技術研究所工業酶工程研究組實驗室保存。

1.2 主要試劑與材料

限制性內切酶、T4 DNA連接酶,NEB公司；高保真DNA聚合酶、MIX酶,康為世紀公司;質粒小提試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒等,TIANGEN公司;無氨基酵母氮源(YNB)培養基、葡萄糖,Solarbio公司;生物素，生物基礎公司；無水甲醇,國藥集團化學試劑有限公司;PCR所需引物，北京擎科有限公司合成;超納濾膜芯,杭州瑞納膜工程有限公司。

2 實驗方法

2.1 Brazzein和PDI共表達質粒的構建

按照畢赤酵母密碼子偏好性合成Brazzein 基因(KF013250.1)，并克隆到穿梭質粒pPIC9K多克隆位點EcoR I和NotI之間，構建重組表達質粒pPIC9K-Brazzein。將重組表達質粒pPIC9K-Brazzein以及空白質粒pPIC9K分別用SacI酶切線性化，電轉(1 500 V)到畢赤酵母GS115感受態，用1 mol/L山梨醇緩沖液重懸細胞，然后將轉化產物涂布MD平板。將重組質粒pPICZA-PDI用SacI單酶切線性化，然后電轉化到畢赤酵母GS115(pPIC9K-Brazzein)感受態中，用1 mol/L山梨醇緩沖液重懸保護，涂布Zeocin平板。

2.2 重組畢赤酵母工程菌GS115 pPIC9K-Brazzein的誘導表達

將畢赤酵母重組工程菌株GS115(pPIC9K-Brazzein)劃線于YPD平板，挑取重組畢赤酵母工程菌單克隆接種到10 mL BMGY培養基中，30 ℃、220 r/min培養36 h左右，OD600達到3左右。然后收集菌體轉接到20 mL BMMY誘導培養基中，并加400 μL無水甲醇進行誘導表達。每隔24 h添加體積分數為2%的無水甲醇，取2 mL誘導菌液離心并保留上清液，用于后續分析畢赤酵母表達重組Brazzein的水平。

2.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)

取畢赤酵母誘導表達發酵上清液1 mL，用三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)溶液沉淀蛋白，得到的蛋白樣品加入20 μL 6 mol/L的脲素溶解，并加入5 μL 5×蛋白電泳上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸10 min。樣品冷卻后取10 μL蛋白樣品、5 μL蛋白Marker開始上樣，并采用90～120 V電泳。

2.4 重組Brazzein的發酵小試

挑取GS115(pPIC9K-Brazzein)單菌落接種于400 mL YPD液體培養基中，培養至OD600=10左右；將種子液接種至發酵培養基BSM(體積分數4%甘油、BSM基礎鹽類、PTM1鹽類)中30 ℃培養，通氣量400 L/h、初始轉速為400 r/min，設定溶氧為20%，并設置溶氧與轉速聯動。當溶氧(dissolved oxygen,DO)<20%，轉速逐步提高以控制DO值為20%，最大轉速為800 r/min，用體積分數28%的NH3·H2O調節培養基的pH為5.0左右。發酵21 h左右，甘油消耗殆盡，當DO升高,轉速降低時,每升加入含12 mL PTM1的甘油進行補料。補料至濕菌體質量達到180～220 g/L后停止；待甘油完全耗盡后饑餓1 h，DO上升后進行甲醇補料培養。

2.5 表達產物的初步膜法分離純化

重組菌誘導到最佳時間后，離心收集菌體發酵上清液，利用瑞納小型1812超濾-納濾膜過濾系統進行純化過濾。膜芯先選用星達Synder1812V0.1/1 000 kDa進行預過濾除菌體，然后采用星達Synder1812MK/30 kDa進行超濾除雜質，最后采用星達Synder1812XT/1 kDa、星達Synder1812NFG/600 Da或星達Synder1812VT/3 kDa分別在3種壓力(0.2、0.4、0.6 MPa)下進行納濾，回收可溶性重組甜蛋白，過濾溫度為20 ℃。加入2倍體積純水對納濾體系進行清洗后，獲得重組甜蛋白濃縮液。采用凍干的方式進行干燥濃縮，稱量得到的粉末，密封保存在-20 ℃，用于后續Brazzein的活性檢測。

2.6 重組Brazzein的甜味檢測

雙盲感官評定：將甜蛋白樣品加蒸餾水稀釋100倍，配制成質量濃度為10 g/L的母液，再梯度稀釋為質量濃度1、0.5、0.25、0.125 g/L的溶液，用20 g/L的蔗糖作為對照，秘密編號(A:1 g/L蛋白、B:0.5 g/L蛋白、C:0.25 g/L蛋白、D:0.125 g/L蛋白、E:20 g/L蔗糖)，選取9名志愿者組成口感評價小組，亂序品嘗上清液，每人單獨描述對品嘗樣品和蔗糖的甜度進行排序打分，并記錄數據。確定與20 g/L的蔗糖甜度相當的樣品濃度，從而計算出目的甜蛋白的甜度。

2.7 重組Brazzein的抑菌實驗

利用制備出的重組Brazzein配制待測水溶液，質量濃度為30 mg/mL，進行抑菌試驗。指示菌分別為：枯草芽孢桿菌ATCC6633、金黃色葡萄球菌ATCC27217、大腸桿菌ATCC25922、白念珠菌ATCC36082、檜狀靑霉ATCC10519、干酪乳桿菌ATCC334、嗜酸乳桿菌ATCC4356、糞腸球菌ATCC29212。最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)值測定采用試管二倍稀釋法，向滅菌試管中加入各自培養基(pH 7.5)1 mL，依次編號，在第1管中加入濃縮樣品1 mL，混勻后吸取1 mL至第2管，依次類推至第9管，棄去最后吸取的1 mL，然后于每管中加入0.1 mL濃度稀釋至1×108CFU/mL菌液，第10管加入菌液不含巴西甜蛋白作為陽性對照，第11管只加營養肉湯作為陰性對照，分別依次測定MIC值。

3 結果與分析

3.1 pPIC9K-Brazzein表達質粒的構建

如圖1所示，優化后的基因連接到pPIC9K載體的EcoR I和NotI酶切位點，構建重組質粒pPIC9K-Brazzein。

圖1 重組質粒構建示意圖Fig.1 Schematic diagram of recombinant plasmid construction

3.2 重組畢赤酵母GS115基因組的PCR鑒定

利用AOX引物PCR驗證pPIC9K-Brazzein整合畢赤酵母基因組情況，篩選Mut+整合，可見2條帶，1條與目的基因相關，大小為Brazzein基因片段大小加492 bp，另1條為AOX1基因(大約為2.2 kb)。如圖2所示，條帶大小分別為2.2 kb和660 bp，測序結果顯示正確轉化，Brazzein基因被成功整合到畢赤酵母GS115基因組上。

M-核酸分子標記物；1、2-GS115(pPIC9K-Brazzein)轉化子；--陰性對照；+-陽性對照圖2 酵母轉化子的PCR驗證Fig.2 Yeast transformant PCR verification

利用Text引物PCR驗證pPICZA-PDI整合畢赤酵母基因組情況，篩選正確的陽性轉化子，如圖3所示。陽性轉化子在瓊脂糖凝膠電泳中可見1條帶，大小即為PDI的大小1 554 bp。測序結果顯示正確轉化，PDI基因被成功整合到畢赤酵母GS115基因組上。最終成功構建了重組菌株GS115(pPIC9K- Brazzein，pPICZA-PDI)。

M-核酸分子標記物；1、2、3、4-GS115(pPIC9K-Brazzein，pPICZA-PDI)轉化子圖3 重組共表達菌株轉化子PCR驗證Fig.3 PCR validation of recombinant co-expressing strainstransformants

3.3 重組Brazzein的表達

如圖4所示，在6.5 kDa處重組子有1條明顯的蛋白條帶，和理論分子質量大小一致，而對照沒有此條帶。用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測重組Brazzein質量濃度，表達量達到1 g/L。

M-蛋白分子標記物；1-GS115(pPIC9K-Brazzein,pPICZA-PDI)；2-GS115(pPIC9K,pPICZA-PDI)圖4 重組Brazzein表達電泳圖Fig.4 SDS-PAGE for the expression of recombinant Brazzein

3.4 5 L發酵罐高密度培養和超濾納濾膜法分離

發酵過程分為3個階段：甘油批式發酵、甘油補料培養和甲醇補料培養。甘油批式發酵至22.95 h時，甘油消耗殆盡，發酵罐中DO值迅速上升，達到41%，細胞濕質量達到107.2 g，此時開始進入第2階段，甘油補料培養，增加細胞量。在培養至32.02 h時停止甘油補料培養，進入第3階段，甲醇補料培養。在發酵至142.61 h時，菌體生長趨于穩定，每升發酵液中細胞濕質量達到301 g，畢赤酵母表達Brazzein發酵曲線如圖5所示。利用超濾-納濾膜過濾系統對發酵上清液進行純化過濾，對比不同壓力下SynderVT/3 kDa、SynderXT/1 kDa和SynderNFG/600 Da對于重組Brazzein的回收率，結果如圖6所示。使用SynderNFG/600 Da在0.6 MPa工作壓力下的回收效率最高，可達70.8%。

圖5 畢赤酵母表達Brazzein誘導發酵曲線Fig.5 Fermentation curve of Pichia pastoris expressionBrazzein

3.5 重組Brazzein的甜味檢測

隨機提供給評價員A、B、C、D、E五種樣品，經過多次品嘗，通過對重組Brazzein和蔗糖的雙盲感官檢驗，采用排序法，并按甜度高低進行排序，給出每個樣品的秩次，統計每個樣品的秩和，采用弗里德曼(Friedman)檢驗分析，結果如表1所示。

圖6 三種納濾膜在不同壓力下對重組Brazzein的回收率Fig.6 Recovery of recombinant Brazzein by three nanofiltrationmembranes at different pressures

表1 重組Brazzein與蔗糖的甜度關系感官評定結果Table 1 Sensory evaluation results of the sweetnessrelationship between recombinant Brazzein and sucrose

通過Friedman檢驗計算可知，F=10.044>F0.05=9.49，在0.05的置信水平下，5種溶液的甜度存在顯著差異。根據排序結果，甜度排名為A>B>E>C>D。進一步分組比較分析(least significance difference,LSD)，結果表明B和E之間沒有顯著差異。表明0.5 g/L的蛋白樣品溶液甜度與20 g/L蔗糖無明顯差異(P>0.05)，通過計算，甜味蛋白的甜度約為蔗糖的40倍。而后進行重組Brazzein的甜味和雜味檢測，結果表明,重組Brazzein具有明顯的甜味，同時反饋有苦味，增加空白對照后發現，產生苦味主要原因為超濾納濾純化過程未能將發酵液中苦澀物質完全去除。另外，有2位評價員認為重組Brazzein的甜味持久性長于蔗糖。

3.6 重組Brazzein的抑菌作用

重組Brazzein對5種菌的抑制作用結果如表2所示。由表2可知，表達后的巴西甜蛋白對部分細菌和真菌抑菌性較弱，其中對白念珠菌的MIC值為15 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC值為7.5 mg/mL，對檜狀青霉的MIC值為3.75 mg/mL，對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌沒有發現明顯的抑菌效果。

表2 重組Brazzein抑菌作用結果Table 2 Antibacterial effect of recombinant Brazzein

4 結論與討論

本研究中重組畢赤酵母工程菌株分泌表達的巴西甜蛋白占總蛋白的80%以上。將巴西甜蛋白與PDI進行共表達在一定程度上減少了對宿主本身分子伴侶的占用，提高了重組蛋白的分泌效率，并最終實現了1 g/L的胞外分泌表達量，高于之前報道的385 mg/L蛋白產量[17]，為其他甜蛋白的外源表達提供了參考。

對獲得的重組巴西甜蛋白進行生物活性檢測，甜味測試結果顯示其甜度是蔗糖的40倍，與文獻報道的2 000倍存在差距，推測甜味降低的原因主要有2方面：1)宿主對關鍵氨基酸的修飾作用。由于巴西甜蛋白甜味主要由位于分子彈性環周邊包括Arg43的氨基酸殘基參與產生[18]，化學修飾其中部分位點會導致甜味的降低或消失[19]。而酵母對外源蛋白的糖基化修飾比較常見，也是許多外源蛋白活性降低的重要原因[20]。2)重組蛋白沒有正確折疊。甜蛋白的甜味同樣依賴于蛋白的正確折疊，經畢赤酵母與PDI共表達的重組巴西甜蛋白是否與天然構型完全一致還缺少研究。這也是下一步增強重組巴西甜蛋白甜味的主要研究方向。

對巴西甜蛋白的抑菌活性結果表明，巴西甜蛋白對部分細菌和真菌具有較弱的抑菌性，其中對白念珠菌的MIC值為15 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的MIC值為7.5 mg/mL，對檜狀青霉的MIC值為3.75 mg/mL，而對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌沒有發現明顯的抑菌效果。根據以上實驗結果和預期的口服量分析，食用重組巴西甜蛋白后對腸道菌群影響作用較弱。