螺旋篩板氣升式反應器在真菌發酵中的應用

李想，陳瑜琦，王子凡，鄭志永,2*，陳海琴，高敏杰*，詹曉北

1(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學 環境與土木工程學院，江蘇 無錫 214122)3(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

螺旋篩板氣升式反應器(airlift reactor with helical sieve plate,ALR-HSP)是本研究室在經典氣升式反應器(conventional airlift reactor,CALR)的基礎上研發出來的，靠導流筒裝置的引導使多相進行循環混合的反應器，它與CALR的主要區別在于其導流筒上升段安裝有螺旋上升的多孔篩板[1-2]。在空氣-水試驗中，ALR-HSP展現出比CALR更好的傳質性能和節能的特性，裝有螺旋篩板的這種結構能夠有效阻止氣泡聚并，增大氣液比表面積從而提高傳質效率，在相同通風量條件下氣含率和體積傳質系數分別增加38%～53%和76%～144%[3]。

氣升式反應器雖然具有結構簡單、剪切力小和能耗低的特性，但由于其能調控的參數較少，操作魯棒性差，傳質效率較低，因此工業上只有少量菌株能夠用氣升式反應器來培養。導流筒上安裝螺旋篩板后，反應器的傳質性能得到提高，操作魯棒性明顯改善，這增加了工業菌株用氣升式反應器來培養的適用性。真菌具有生長速度較慢、耗氧量較少和對剪切力比較敏感的特性，是潛在的可以使用氣升式反應器來進行培養的菌株。

高山被孢霉(Mortierellaalpine)是1株生產多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)的絲狀真菌[4-5]。其對剪切力敏感[6]，但由于CALR不能滿足其耗氧需求，因此高山被孢霉的培養依舊選擇機械攪拌式反應器。在采用機械攪拌式反應器培養時轉速不宜過高，這在一定程度上減弱了機械攪拌罐在操作魯棒性上較強的優勢，使用ALR-HSP有望解決這個問題。另外畢赤酵母是一種應用廣泛的外源蛋白表達系統，也是一種在工業發酵中常用的菌株，能生產出大量的重組蛋白質[7-8]。同樣因CALR的供氧能力有限，不能滿足菌株的耗氧需求，因而使用機械攪拌罐[9-10]。本文采用傳統氣升式反應器和帶有螺旋篩板氣升式反應器，對高山被孢霉和畢赤酵母進行培養，分別考察這2株菌的發酵過程參數，分析螺旋篩板在耗氧微生物發酵中產生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗裝置

發酵用ALR-HSP是以比歐SSTC型65 L氣升式反應器(瑞士比歐生物工程公司)作為改造對象，在反應器內安裝自行設計的導流筒、開孔率61%的螺旋篩板與圓錐面形的氣體分布器，具體樣式如圖1所示。本實驗的反應器有2個，一個是導流筒上有螺旋篩板的反應器ALR-HSP，作為實驗組；另一個是導流筒上沒有螺旋篩板的反應器CALR，作為對照組。實驗裝置主要結構參數如表1所示。

1-出氣口;2-氣液分離區;3-導流筒;4-螺旋篩板;5-夾套;6-溶氧電極;7-圓錐形氣體分布器;8-進氣口圖1 螺旋篩板氣升式反應器Fig.1 Experimental device of helical sieve airlift

表1 實驗氣升式反應器的結構參數Table 1 Structure parameters of airlift experiment reactor

1.1.2 菌株與試劑

高山被孢霉(MortierellaalpineATUS2222)由江南大學食品學院贈送。畢赤酵母(PichiapastorisKM71)購于Invitrogen公司。

酵母粉，北京索萊寶科技有限公司；甘油、K2SO4、KH2PO4、MgSO4、KOH、磷酸等，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

1.1.3.1 高山被孢霉培養基

種子培養基(g/L)：葡萄糖 20，酵母提取物 5，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.51，KNO310。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖 30，酵母提取物 1.5，酒石酸銨 2.0，KH2PO47，MgSO4·7H2O 1.5，Na2HPO410，無水CaCl20.1，FeCl3·6H2O 8 mg/L，ZnSO4·7H2O 1 mg/L，CuSO4·5H2O、Co(NO3)2·6H2O、MnSO4·5H2O 0.1 mg/L。

1.1.3.2 畢赤酵母培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)種子培養基(g/L)：酵母粉 10.0，葡萄糖 20.0，蛋白胨 20.0。

發酵培養基(g/L)：甘油 26.0，K2SO41.0，MgSO41.0，CaSO40.1，KOH 20.0，(NH4)2SO45.0，PTM1 10 mL，H3PO420 mL/L，pH 6.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法

1.2.1.1 高山被孢霉

種子液制備：從斜面上挑取活化后的菌種接種至裝有100 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，200 r/min、28 ℃培養48 h后，按體積分數1%的接種量接種，使用分散器打散的菌絲體片段，并傳代2次，每次均在200 r/min、28 ℃條件下培養36 h，即得到種子液。

發酵罐培養：將36 L的初始發酵培養基置于65 L的氣升式反應器內，滅菌，接種前調節發酵培養基維持在28 ℃、pH 6.0。加入4 L的種子液，在恒定通氣量10 L/min條件下進行培養。

1.2.1.2 畢赤酵母

種子液制備：將保存在甘油管中的菌體接種到斜面培養基上，放入30 ℃培養箱培養2 d。將單個菌落接入裝有50 mL培養基的500 mL三角瓶，溫度30 ℃，轉速220 r/min，培養18 h，直至OD600達到2.0。

發酵罐培養：將28.5 L的初始發酵培養基置于65 L的氣升式反應器內，滅菌，接種前調節發酵培養基維持在30 ℃、pH 6.0。加入1.5 L的種子液，在恒定通氣量40 L/min條件下進行培養，待甘油耗盡后停止培養。

1.2.2 細胞濃度測定

將用去離子水洗滌過的高山被孢霉進行冷凍干燥，采用干重法測定菌體濃度[11]，采用濁度法測定畢赤酵母菌體濃度[12]。

1.2.3 碳源質量濃度測定

1.2.3.1 葡萄糖質量濃度測定

采用SBA-40E型生物傳感儀(山東省科學院生物研究所)測定[13]。

1.2.3.2 甘油質量濃度測定

發酵液中殘余甘油濃度通過HPLC法測定[12]。

1.2.4 NH4-N含量測定

采用水楊酸鈉-次氯酸鈉比色法[14]。

1.2.5 發酵過程中OUR及kLa測定

通過LKM2000A型尾氣分析儀(韓國 LOKAS)記錄發酵尾氣中O2的分壓，按照公式(1)和(2)分別計算O2消耗速率(oxygen uptake rate,OUR)，體積傳質系數(kLa)，計算公式如下：

(1)

(2)

式中：OUR,O2消耗速率，mmol/(L·h)；Qg,通氣流量，m3/s；φO2,氧氣的體積分數，%；V,裝液體積，m3；ρ*,飽和氧質量濃度，mg/L；ρL,實際溶氧質量濃度，mg/L。

1.2.6 脂質含量測定

樣品制備方法如下：將冷凍干燥的菌絲體碾碎，精密稱取約50 mg置于樣品瓶中，提取脂肪酸及甲酯化具體操作見文獻[15]。

采用QP2010型氣相色譜-質譜(日本 Shimadzu公司)分析脂肪酸。色譜柱為DB-WAXetr(30 m×0.32 mm，0.25 μm)。柱箱溫度在150 ℃下保持3 min，然后以10 ℃/min升至190 ℃，隨后以5 ℃/min升至220 ℃持續16 min。質譜在m/z50～550的掃描范圍內運行，離子源溫度為220 ℃，電子轟擊源能量為70 eV，進樣量為1 μL。按照上述分析方法得到不飽和脂肪酸甲酯的總離子流圖，如圖2所示。并通過與商業脂肪酸甲酯標準(GLC.463，Nu-Chek，Elysian，MN，美國)進行比較,鑒定脂肪酸甲酯，鑒定結果如表2所示。

圖2 高山被孢霉產油脂的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of lipids produced byM. alpine

表2 高山被孢霉合成的油脂組分分析Table 2 Components of lipids produced by M. alpine

2 結果與討論

2.1 發酵過程曲線

高山被孢霉和畢赤酵母的發酵過程曲線如圖3所示。高山被孢霉的生長可以分為延滯期、對數期(8～40 h)、穩定期3個階段(圖3-a，b)。反應器在對數期，菌體量增多代謝加快，導致2個反應器的溶解氧(dissolved oxygen,DO)濃度均迅速下降，培養基中的底物濃度迅速降低。在對數生長后期，2反應器的DO值差別顯著，ALR-HSP和CALR的DO值分別在35%和10%左右后趨于穩定。在培養40 h后，培養基中氮源的耗盡限制了菌體生長，菌體濃度趨于穩定，菌體生長進入穩定期。培養結束后，ALR-HSP中的菌體濃度比CALR增加約10%。菌體濃度增加可能是在ALR-HSP中氧氣供應更為充足，更適合高山被孢霉的生長[16]。

畢赤酵母生長過程可分為延滯期、對數期、穩定期3個階段(圖3-c，d)。菌體進入對數生長期(12～32 h)后，代謝加快，耗氧量增加，2個反應器的DO值均開始下降，并出現明顯差異。菌體在此階段耗氧量大，而氣升式反應器的供氧能力有限，致使2反應器的溶氧先后降為0。直到36 h后，ALR-HSP和CALR的DO值開始上升，此時甘油質量濃度過低限制了菌體的生長，菌體進入穩定期(36～48 h)。最終ALR-HSP中菌體的濃度比CALR增長約20%。其原因可能是CALR中菌體在溶氧限制條件下產生了大量副產物導致細胞對底物的得率系數較低[7,17-18]。

a-高山被孢霉溶解氧體積分數和生物量曲線;b-高山被孢霉葡萄糖質量濃度和NH4-N質量濃度曲線;c-畢赤酵母溶解氧體積分數和生物量曲線;d-畢赤酵母甘油質量濃度和NH4-N質量濃度曲線實心-ALR-HSP;空心-CALR；三角形-菌體濃度;菱形-溶解氧體積分數;圓形-NH4-N質量濃度;正方形-葡萄糖/甘油質量濃度圖3 高山被孢霉和畢赤酵母在ALR-HSP和CALR中的發酵過程曲線Fig.3 Process curves for the M. alpine and P. pastoris cultivation in the ALR-HSP and CALR

2.2 生長速率與比生長速率

高山被孢霉在2種反應器內培養的生長速率曲線和比生長速率分別如圖4-a，b所示。菌體進入對數期后，生長速率迅速增加，并在28 h達到峰值后開始變慢。根據測定溶氧生長極限值(當DO值低于生長限制值時，菌體生長受到限制)的方法[16]測得本實驗所用菌體的生長極限值約為30%。在營養物充足的情況下，菌體生長速率和比生長速率降低是由于DO限制造成[19]。ALR-HSP培養菌體的最大生長速率和最大比生長速率分別比CALR提高25%和30%，這說明了ALR-HSP在氧傳遞性能上的優越性。圖4-c，d為畢赤酵母在兩種反應器內培養的生長速率曲線和比生長速率曲線。菌體生長到12 h后開始進入對數生長期，此時生長速率迅速增加，到20 h后，設備的最大供氧能力限制著菌體的生長速率。由于ALR-HSP在供氧能力優越性，使得ALR-HSP的細胞生長速率和比生長速率分別比CALR提高40%和20%。

a-高山被孢霉生長速率曲線;b-高山被孢霉比生長速率曲線;c-畢赤酵母生長速率曲線;d-畢赤酵母比生長速率曲線圖4 高山被孢霉和畢赤酵母在ALR-HSP和CALR中培養的生長速率與比生長速率Fig.4 Growth rate and specific growth rate for the M. alpine and P. pastoris cultivation in the ALR-HSP and CALR

2.3 高山被孢霉單位菌體脂肪酸組成分析

各脂肪酸的量隨著發酵時間不同而發生變化，脂肪酸總量隨發酵時間延長增多，最后趨于恒定(圖5)。相同培養時間下(發酵時間大于48 h)，ALR-HSP中高山被孢霉的脂肪酸總含量明顯高于CALR。2個反應器對高山被孢霉中脂肪酸組成的影響如表3所示。從表3中可知，ALR-HSP中的菌體產油脂的總量比CALR提高40%，菌體對碳源的得率提高了6%，總油脂量對碳源的得率提高了45%。菌體中產生幾種主要脂肪酸含量存在顯著差異，對比脂肪酸種類發現，ALR-HSP中菌體產生的脂肪酸的不飽和度比CALR中的高。其原因可能是在供氧充足時，菌體更容易合成不飽和度高的脂肪酸[20-21]，這說明ALR-HSP的供氧能力強于CALR。

1-ALR-HSP;2-CALR圖5 不同培養時間下，在ALR-HSP和CALR中培養的高山被孢霉的單位菌體中脂肪酸組成變化Fig.5 Fatty acid composition changes of M. alpine plantscultivated in ALR-HSP and CALR under differentculture time

表3 兩反應器對高山被孢霉中脂肪酸組成的影響Table 3 Effects of two reactors on fatty acid composition by M. alpine

2.4 氧氣消耗速率(OUR)和體積傳質系數(kLa)

從圖6中可以看出，2個反應器中菌體的OUR均在短時間內迅速上升，并在36 h左右開始達到最大，之后由于反應器供氧有限和氮源匱乏等問題，使得菌體生長受限，致使OUR迅速下降。通風發酵過程中的DO同時取決于傳氧速率(oxygen transfer rate,OTR)和OUR。其中OUR取決于細胞密度、代謝活力和營養條件,OTR取決于設備性能、操作條件和發酵液性質。在恒定通風條件下，可近似地認為OTR主要與設備性能有關。又在穩態條件下，有OTR=OUR。因此在穩態條件下，微生物的OUR越高，其對應反應器的性能越好。在48～96 h期間DO值無明顯變化，此時發酵過程達到穩定狀態，有OTR=OUR。從圖6-a中可得出有篩板反應器中菌體的OUR比無篩板反應器中的菌體的OUR高21%～36%。

a-高山被孢霉培養過程中氧氣消耗速率變化;b-高山被孢霉培養過程中體積傳質系數變化圖6 使用ALR-HSP 和 CALR培養高山被孢霉過程中的氧氣消耗速率和體積傳質系數Fig.6 The comparison of OUR and kLa forM. alpine in the ALR-HSP and CALR

圖6-b為培養體系在穩態條件下，根據公式(2)計算出來的對應發酵時間的體積傳質系數(kLa)。在通氣量為10 L/min條件下，ALR-HSP和CALR的kLa值分別為(0.023 2±0.002 1) s-1和(0.011 5±0.001 3) s-1。ALR-HSP的kLa比CALR提高1倍多，這進一步說明了ALR-HSP的優勢。在進行通風發酵實驗前，對反應器進行空氣-水實驗，采用動態驅趕法[22]測得在通氣量10 L/min條件下，ALR-HSP和CALR的kLa分別為(0.017 3±0.001 6) s-1和(0.009 1±0.000 6) s-1。與使用尾氣分析儀測出來的kLa數值接近，但也存在差異，其原因可能是測定方法和測量介質不同[23]。

氣升式反應器的主要能量消耗來源于空壓機，通風量越大，能耗越大。在氣升式反應器中，牛頓流體常用公式(3)[23]估算kLa，同理也可以使用此公式計算kLa對應的表觀氣速(Ug)，公式(4)[24]可用來計算通氣過程的功率消耗。

(3)

(4)

式中：C和a,常數，在純水條件下C=0.47，a=0.82；Ug,表觀氣速，m/s；P,空壓機功率，kW；pi,空壓機進口壓力，bar；po,空壓機出口壓力，bar；Qg,通氣流量，m3/s。

根據公式(3)和(4)計算得出，CALR要達到ALR-HSP的kLa需要多消耗1倍的功率，這說明ALR-HSP的能量利用效率更高。

培養過程中現場觀察發現，ALR-HSP中液面以上的泡沫數量明顯比CALR多。在有篩板條件下，大氣泡被分割為更多的小氣泡，小氣泡的熱力學性質穩定，不容易破碎，不斷在液面上方累積。這是今后需要研究者解決的問題，為解決氣泡過多問題，可以與其他消泡設備同時使用，例如：離心消泡[25]和旋擊分離器[26]。另外在滅菌結束后高山被孢霉的絲狀菌株會附著在篩孔板上，使清洗變得復雜。但總體上，ALR-HSP相比于CALR，其傳質效率和能量利用率上均得到提高，這在提升氣升式反應器應用范圍方面具有顯著的工業價值。

3 結論

螺旋篩板氣升式反應器(ALR-HSP)在畢赤酵母和高山被孢霉的培養過程中表現出了比經典氣升式反應器(CALR)更加優良的傳質特性和節能特性。在高山被孢霉的培養中，在相同功率消耗條件下，ALR-HSP內菌體的最大生長速率和最大比生長速率分別比CALR提高25%和30%，菌體量增長約10%，脂肪酸總量提高約40%；在畢赤酵母培養中，在相同功率消耗條件下，ALR-HSP內的菌體濃度增長20%，最大生長速率和最大比生長速率分別比CALR提高40%和20%。在低通風量條件下，ALR-HSP的傳質效率比CALR提高了1倍多。但在培養過程中ALR-HSP也存在一些問題，如在液面上泡沫更多和滅菌后的清洗更為復雜。這些問題有待進一步的研究和解決，以期待這種新型的氣升式反應器能夠在工業上取得廣泛應用。