人工接種腸膜明串珠菌對發酵櫻菜中的化學成分和微生物數量的影響

劉笑笑,金永梅,李姝睿,李勝男,王嵩,魏春雁*

1(吉林省農業科學院，吉林 長春， 130033) 2(農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室(長春)，吉林 長春， 130033)

朝鮮族泡菜是極具民族特色的發酵型泡菜，具有獨特濃厚的風味且富含乳酸菌和乳酸[1-3],深受廣大消費者喜愛。目前，朝鮮族泡菜的生產方式主要是自然發酵，但存在發酵周期長、產品質量不穩定、亞硝酸鹽含量高等缺點[4]。人工接種發酵朝鮮族泡菜是一種趨勢，也是發酵技術現代化的標志，而其達到快速、穩定和優質的關鍵在于菌種[5]。

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)是自然發酵產品中的優勢菌[6]，對人和動物均無毒性和致病作用，具有抗氧化、改善產品風味和拮抗致病菌能力[7-8]。因此，將其應用于朝鮮族泡菜中，對人工接種生產方式進行基礎研究具有重要意義。

櫻菜是延邊朝鮮族人種植的一種特色蔬菜，生長期短且具有季節性，味道適口，營養豐富，以其為原料制成朝鮮族泡菜，不僅提高了營養價值，還改善了其貯藏性[3]。發酵櫻菜口感源于發酵過程中微生物代謝而發生的復雜變化，而各種化學成分以及微生物數量變化對發酵櫻菜營養品質、口感和貯藏性起著至關重要的作用[9-10]。

本研究將具有降解亞硝酸鹽功能的腸膜明串珠菌人工接種制作發酵櫻菜，對比體積分數為1%的接種量、體積分數為5%接種量和自然發酵3種發酵條件下發酵第0、7、14、21、28、35、42天的發酵櫻菜中亞硝酸鹽含量、還原糖含量、氨基酸態氮含量、總酸、pH、菌落總數、大腸菌群、乳酸菌數、酵母菌數變化情況，為人工接種生產朝鮮族泡菜提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試驗原料

櫻菜，挑選無腐爛、無病蟲害且成熟的櫻菜，延邊州延吉市農貿市場售。

1.1.2 試驗菌株

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)JNZB003,由本實驗室從延邊朝鮮傳統發酵櫻菜中分離，在中國典型培養物保藏中心保藏，編號為CCTCC No：M 2018129。

1.1.3 試驗試劑

MRS固體培養基、MRS液體培養基、平板計數瓊脂(plate count agar,PCA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA),青島高科園海博生物技術有限公司；結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violet centre red bile agar,VRBA),北京奧博星生物技術有限責任公司；NaCl(分析純),北京化工廠；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅(分析純),天津光復精細化工研究所；NaNO2(化學純),天津市化學試劑一廠；對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺(分析純),國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 儀器設備

PRESOCLAVE-Ⅱ高壓滅菌器,西班牙 SELECTA；BT 124S電子天平,中國賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；VF 611超純水系統，德國SARTORIUS；T6新世紀分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；DNP-9162BS-Ⅲ電熱恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；S210 pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 朝鮮族傳統發酵櫻菜制作

初腌：挑選無腐爛、無病蟲害的成熟櫻菜，將其在通風良好的室外晾曬，待櫻菜變黃，清洗干凈，用鹽進行初腌，待腌蔫。

備料：將辣椒粉、姜粉、蒜沫、蘋果梨塊等用少量水拌勻，備用。

自然發酵：每次取少量初腌好的櫻菜，用備料涂勻后，放入發酵罐中，蓋好蓋子，置于冷藏箱(4 ℃)進行發酵。

人工接種發酵：在備料里混勻菌種，接種菌液中活菌數在108CFU/mL以上，分別以體積分數為1%和5%接種量，放入發酵罐中，蓋好蓋子，置于冷藏箱(4 ℃)進行發酵。

1.2.2 試驗設計

試驗分為3組，自然發酵組、體積分數1%接種組、體積分數5%接種組。每組重復3個，其中自然發酵組為對照，均在4 ℃條件下進行發酵，對發酵第0、7、14、21、28、35、42天的發酵櫻菜中的亞硝酸鹽含量、還原糖含量、氨基酸態氮含量、總酸、pH、菌落總數、大腸菌群、乳酸菌數、酵母菌數進行測定。

1.2.3 測定方法

1.2.3.1 亞硝酸鹽含量

根據GB 5009.33—2010《食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的測定》，采用鹽酸萘乙二胺法進行測定[11]。

1.2.3.2 還原糖含量

根據GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》，采用3,5-二硝基水楊酸比色法進行測定[12]。

1.2.3.3 氨基酸態氮含量

根據GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》，采用甲醛滴定法進行測定[13]。

1.2.3.4 總酸含量

根據GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，采用酸堿滴定法進行測定[14]。

1.2.3.5 pH

取發酵罐中多個位置的發酵液進行混合，用pH計測定直至數值穩定，連續測3次，取平均值。

1.2.3.6 菌落總數測定

根據GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》進行測定[15]。

1.2.3.7 大腸菌群測定

根據GB 4789.3—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》，采用平板計數法進行測定[16]。

1.2.3.8 乳酸菌測定

根據GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》進行測定[17]。

1.2.3.9 酵母菌測定

根據GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》，采用平板計數法進行測定[18]。

1.3 數據處理

用Excel 和SPSS 17.0進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 櫻菜發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化

櫻菜發酵過程中亞硝酸鹽含量變化趨勢見圖1。

圖1 櫻菜發酵過程中亞硝酸鹽含量和pH的變化Fig.1 Change of nitrite content and pH value duringthe fermentation of L. sativum注：不同小寫字母表示差異顯著(下同)

由圖1所示，自然發酵組和體積分數5%接種組中亞硝酸鹽含量均先增加再降低，并在第7天亞硝酸鹽出現明顯的高峰，自然發酵組上升的速度與含量顯著高于接種組(P<0.05)。而體積分數1%接種組隨發酵時間的延長，亞硝酸鹽含量逐漸降低并趨于穩定，且在發酵第7天已降至國家標準以下(<20 mg/kg)。同一時間，人工接種量不同，發酵櫻菜中亞硝酸鹽殘留量也不同，整個發酵過程中，以體積分數1%接種組保持含量較低，表明人工接種發酵有利于抑制亞硝酸鹽的生成與積累。

自然發酵組在前7 d亞硝酸鹽含量快速增加，可能由于蔬菜及發酵器上的革蘭氏陰性菌分泌硝酸還原酶，導致大量的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[19]。人工接種組中的腸膜明串珠菌開始就高于自然發酵組，能立即進行乳酸發酵，產生大量乳酸[20]，使pH在5.0以下，此時硝酸還原酶酶活性開始對亞硝酸鹽含量變化起作用，因此，接種組亞硝酸鹽含量逐漸降低并趨于穩定。本試驗亞硝酸鹽含量變化規律與何淑玲[21]研究結果一致。

2.2 櫻菜發酵過程中pH的變化

pH影響發酵過程中微生物的種類、數量以及代謝產物的變化，進而影響發酵櫻菜的品質。

由圖1所示，櫻菜發酵過程中pH呈規律變化，3組發酵櫻菜在0～28 d，pH均逐漸降低，人工接種組pH下降速度快于自然發酵組，但差異不顯著(P>0.05)，這是由于自然發酵組發酵起始乳酸菌少，而接種組起始接種了腸膜明串珠菌，因此，產酸多于自然發酵組。隨著發酵時間的延長，乳酸菌成為優勢菌，發酵產生乳酸，pH逐漸降低[22-23]。

28～35 d，pH穩定在3.7～3.8，此時，發酵成熟，pH趨于穩定，這與杜書[24]、馬歡歡等[25]和韓宏嬌等[10]的研究結果相似。

2.3 櫻菜發酵過程中還原糖含量的變化

在發酵過程中，還原糖是發酵底物，可以表征出發酵過程中微生物的生長情況以及代謝產物的量。

櫻菜發酵過程中還原糖變化如圖2所示，3組發酵櫻菜中還原糖含量均呈先增加再降低趨于穩定。

圖2 櫻菜發酵過程中還原糖含量的變化Fig.2 Change of reducing sugar during the fermentationof L. sativum

0～7 d 還原糖質量分數呈上升趨勢，分析認為，一是櫻菜本身還原糖等營養物質不斷溶出，此時，微生物活動弱，對還原糖的利用速度小于生成速度，二是還原糖是發酵環境中酶的主要電子供體，微生物分泌的酶類將多糖降解為還原糖。7～21 d還原糖質量分數呈下降趨勢，這是由于隨發酵時間的延長，乳酸菌數量增多，活力增強，利用還原糖進行生長代謝所致。21～49 d還原糖質量分數基本趨于穩定略有增加，后期自然發酵組略高于接種組，分析認為隨著微生物生長繁殖的主要碳源被消耗而逐漸減少，微生物活力下降；而自然發酵組略高，是因為菌體的數量和活力下降，對還原糖的利用減少所致。這與馬艷弘等[26]研究結果類似。

2.4 櫻菜發酵過程中總酸含量的變化

總酸是反映櫻菜的發酵程度，影響產品的風味和品質的重要指標。由圖3可知，3組櫻菜發酵過程中，總酸含量均隨發酵時間的延長呈持續上升趨勢，42 d達到最大值，分析認為，一是由于發酵初期，以腸膜明串珠菌的異型乳酸發酵為主，產生的CO2、CHCOOH、CH3CH2OH導致發酵液中總酸含量升高[27-28]，二是隨著發酵時間的延長，乳酸菌成為優勢菌，利用發酵櫻菜中的營養物質發酵產生有機酸，由此創造的酸性環境促進部分抗酸乳酸菌的繁殖，產生大量乳酸。因此，3組總酸含量持續增加。自然發酵組總酸含量在前14 d上升程度不大，是因為蔬菜自身帶有的乳酸菌和其他微生物在鹽水、低溫和密閉缺氧條件下代謝慢，產生的有機酸速度慢[29]。

圖3 櫻菜發酵過程中總酸含量變化Fig.3 Change of total acid during the fermentation ofL. sativum

人工接種組總酸含量以及上升速度顯著高于自然發酵組(P<0.05)，表明人工接種發酵利于縮短發酵時間，提高生產效率。

42～49 d，3組總酸含量上升程度趨于穩定，這可能是由于發酵后期，發酵環境中的碳源、氮源被大量消耗而不足，乳酸菌的代謝產酸能力減弱并逐漸停止，發酵環境中總酸含量趨于穩定[30]。

2.5 櫻菜發酵過程中氨基酸態氮含量的變化

人工接種與自然發酵櫻菜中氨基酸態氮含量與發酵時間關系如圖4所示。3組發酵櫻菜中氨基酸態氮含量變化趨勢基本一致，均先增加后降低，自然發酵組上升速度與含量高于人工接種組。

圖4 櫻菜發酵過程中氨基酸態氮含量變化Fig.4 Change of amino acid nitrogen during the fermentationof L. sativum

0～7 d呈現上升趨勢，這可能是由于初期微生物數量少、代謝活動弱，但隨著發酵時間的延長，微生物數量增多，代謝產生蛋白酶，氨基酸態氮含量逐漸增加。7～28 d整體呈下降趨勢，28～49 d基本趨于穩定，可能由于微生物活動，造成酸性發酵環境抑制蛋白酶的活性，同時發酵櫻菜中肽、氨基酸等逐漸被微生物利用[31]。

2.6 櫻菜發酵過程中菌落總數的變化

菌落總數可直觀反映發酵櫻菜中雜菌數量，是判斷食用安全性的重要指標。由圖5可知，3組菌落總數在0～7 d呈上升趨勢，7～14 d緩慢下降，14～28 d 下降幅度比較大，28～49 d 趨于平穩，自然發酵組略微升高。

圖5 櫻菜發酵過程中菌落總數變化Fig.5 Change of colony count during the fermentation ofL. sativum

發酵初期環境利于雜菌繁殖，隨著發酵時間的延長，乳酸菌活力增強，逐漸成為優勢菌，代謝產酸抑制雜菌生長，發酵后期自然發酵組菌落總數多于人工接種組，由此可知，人工接種發酵櫻菜可提高食用安全性。

2.7 櫻菜發酵過程中大腸菌群數的變化

大腸菌群是判斷衛生安全的重要指標，由圖6可知，3組發酵櫻菜隨著發酵時間的延長，大腸菌群呈下降趨勢。發酵第0天，自然發酵組略高于人工發酵組，從發酵第7～49天，3組均未檢出大腸菌群。這是由于大腸菌群對酸性比較敏感，隨著乳酸菌發酵產酸，酸性和低氧環境導致大腸菌群生長受到抑制[32]。

圖6 櫻菜發酵過程中大腸菌群變化Fig.6 Change of coliform bacteria during the fermentationof L. sativum

2.8 櫻菜發酵過程中乳酸菌數的變化

乳酸菌是加速發酵櫻菜成熟、形成風味的決定性因素，從圖7可知，發酵起始階段，由于腸膜明串珠菌的加入，人工接種發酵櫻菜中乳酸菌數多于自然發酵組。3組發酵櫻菜中乳酸菌均經歷了增長期(0～14 d)、相對停滯期(14～21 d、42～49 d)和下降期(28～42 d)。體積分數1%接種組在發酵第14天時乳酸菌數達到峰值9.78 lg(CFU/g)，同一發酵時期，自然發酵組中乳酸菌數小于人工接種組。

圖7 櫻菜發酵過程中乳酸菌總數變化Fig.7 Change of lactic acid bacteria during the fermentationof L. sativum

增長期是由于發酵過程中乳酸菌逐漸成為優勢菌；進入停滯期和下降期，一是由于乳酸富集抑制不耐酸乳酸菌的生長[33]，二是隨著發酵時間的延長，微生物生長所需要的營養物質不足，使得乳酸菌數量減少。

2.9 櫻菜發酵過程中酵母菌數的變化

由圖8可知，酵母菌數量呈先增加后降低再趨于穩定，0～7 d酵母菌呈增加趨勢，由于乳酸菌還未成為優勢菌；從7～35 d逐漸下降，乳酸菌開始成為優勢菌，產酸造成的酸性和低氧環境抑制了酵母菌的生長。整個發酵期間，自然發酵組中的酵母菌數多于人工接種組，說明人工接種對酵母菌的抑制優于自然發酵。

圖8 櫻菜發酵過程中酵母菌變化Fig.8 Change of yeasts during the fermentation ofL. sativum

3 結論

通過分析降解亞硝酸鹽腸膜明串珠菌發酵對櫻菜化學成分和微生物變化，研究人工接種發酵和自然發酵對櫻菜品質的影響，發現人工接種發酵櫻菜亞硝酸鹽含量低且降解速度快、總酸含量高、pH下降快、乳酸菌數量多，發酵周期比自然發酵縮短7 d左右；菌落總數和氨基酸態氮含量少，接種發酵比自然發酵食用安全性更高。

通過統計學分析，人工接種發酵和自然發酵相比，亞硝酸鹽含量、總酸含量、氨基酸態氮含量、乳酸菌數量差異顯著(P<0.05)，人工接種發酵組對菌落總數、大腸菌群和酵母菌等有害菌的抑制效果優于自然發酵組。

綜合分析，人工接種發酵櫻菜優于傳統自然發酵，且以體積分數1%接種量較好。