采用實時熒光定量PCR法同時定性定量檢測發酵乳中多種益生菌

覃璐琪，梁曉琳，潘海博，莫明規，饒川艷，聶夢琳，梅麗華，李全陽*

1(廣西大學 輕工與食品工程學院,廣西 南寧,500004) 2(柳州市康小樂牛奶有限公司，廣西 柳州,545007)

益生菌是攝入一定量后，能對人體產生確切健康功效的一類有益活性微生物的總稱[1]。益生菌能夠通過調節機體中的神經傳遞介質來預防老年癡呆癥等病理性衰老[2-3]，其特有的胞外蛋白酶、肽酶通過水解作用，將食物蛋白中具有降壓作用的肽片段釋放，達到降血壓效果[4-5]。同時，益生菌自身也可通過分泌具有抗菌、抗炎特性的次級代謝產物和激活免疫細胞等多種方式，促進宿主腸道菌群健康、提高免疫力[6-7]。隨著對益生菌認識的不斷深入，益生菌在多個領域尤其是在食品中被廣泛研究、應用。目前，常見的益生菌載體主要有微膠囊[8]、豆乳[9]、發酵乳[10]以及果蔬汁飲料[11]等，而發酵乳作為益生菌良好的來源和絕佳的載體，因其豐富的營養和獨特的口感受到眾多消費者的青睞[12]。因此，近年來市場上的發酵乳產品種類不斷增加，其中不乏含有添加多種益生菌的發酵乳制品[13-14]。有研究表明[15-16]，多種益生菌混合制備的發酵乳不僅發酵速度快、風味佳，其抗氧化能力、抑菌能力更優于單一益生菌發酵乳。而復合益生菌發酵乳效果雖好，但這些益生菌相近的生理生化特征使其在同一載體中很難區分[17]。為了克服這一缺陷，有研究在培養基中添加抗生素類抑菌物質對目的菌株進行選擇性計數[18]。但同時有報道稱，添加的抑菌物質同樣會抑制目的菌株正常生長，導致計數結果偏低[19]。我國目前并無明確的益生菌發酵乳生產標準，對發酵乳中益生菌數量尚無明確規定。不夠完善的市場監管體系和技術上的困難，造成了市場上該類產品質量參次不齊的現象。產品包裝雖然標識含有高菌量益生菌，但有無添加、數量是否達標，都是廠家自說自話。為防止此類現象的發生，建立一種科學合理地對混合菌株發酵乳中益生菌定性、定量的檢測方法具有重要意義。

近年來，國內外利用分子生物學手段快速鑒定物種的研究越來越多[20-22]。其中，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qualitative real time polymerase chain reaction，QPCR)[23]因其高特異性、無污染性的優點被廣泛應用于食品檢測中，也逐漸應用至益生菌檢測領域。因此，本研究通過設計干酪乳桿菌LTL1361和羅伊氏乳桿菌LTR1318的種屬特異性引物，建立發酵乳中干酪乳桿菌及羅伊氏乳桿菌的實時熒光定量PCR檢測方法，以期能夠為益生菌混合發酵相關制品中菌株的定性、定量檢測提供新的計量方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)LTL1361、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)LTR1318分離純化自廣西巴馬瑤族自治縣一位身體健康、年齡超百歲的老人的糞便，已保藏于中國典型培養物保藏中心。保藏號：干酪乳桿菌LTL1361：CCTCC M 2019018，羅伊氏乳桿菌LTR1318：CCTCC M 2019017。大腸桿菌DH5α，本實驗室保藏；載體pucm-T、T4 DNA Ligase、Taq酶、Wide Range DNA Marker，TaKaRa公司；細菌DNA提取試劑盒、SYBR qPCR Master Mix，南京諾唯贊生物科技有限公司；SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司。

實時熒光定量PCR儀器(LightCycler?96)，Roche公司；Infinite MP200連續波長多功能微孔檢測器，瑞士TECAN；BIO-RAD伯樂凝膠成像儀、BIO-RAD電泳儀、梯度PCR儀，MJ Bio Rad。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌及樣品DNA的提取

干酪乳桿菌LTL1361、羅伊氏乳桿菌LTR1318按照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗》[24]培養后，采用細菌DNA提取試劑盒提取，具體操作按說明書進行。

益生菌發酵乳DNA的提取，參考吳燕濤等[25]方法并改進：稱取100 mg發酵乳于2 mL離心管，加入750 μL去離子水、100 mL質量分數18% 檸檬酸鈉和50 μL 1 mol/L NaOH，4 ℃ 2 000 r /min 離心5 min，棄上清液，保留沉淀。向沉淀中加入200 μL溶菌酶，37 ℃孵育1 h，再使用細菌DNA提取試劑盒提取益生菌DNA。

1.2.2 引物的設計

從Genbank中分別下載干酪乳桿菌和羅伊氏乳桿菌不同菌株及其他乳酸菌標準株的16S rDNA序列，然后利用DNA Star中MegAlign進行序列比對，尋找種內保守區域，利用Primer 5.0進行引物設計。并通過GenBank中Blast檢測引物特異性，獲得干酪乳桿菌和羅伊氏乳桿菌的種屬特異性引物。引物序列如下,干酪乳桿菌 F:5′-GATGATGTTGGGGATTTTGCG - 3′，R:5′-TATCATAAACCGGGAGATCCCA-3′;擴增片段為149 bp。羅伊氏乳桿菌 F:5′-GCGTTGATGTTGTTGAAGGAATGAGCTTTG-3′，R:5′-CATCAGCAATGATTAAGAGAGCACGGCC-3′;擴增片段為200 bp。引物均由北京擎科生物有限公司合成。

1.2.3 PCR反應條件

普通PCR:反應體系包括12.5 μL TaKaRa TaqTM Version 2.0 plus dye，10 μmol/L上下游引物各1 μL，去離子水補齊至20 μL，每個體系中再添加2 μL DNA模板。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 12 s，30個循環；72 ℃延伸5 min。

PCR產物檢測方法：取5 μL PCR產物，使用質量濃度10 g/L瓊脂糖凝膠和1×TE緩沖液中電泳30 min,電壓100 V,然后采用凝膠成像系統拍照存檔。

實時熒光定量PCR:實時熒光定量PCR反應體系為20 μL，其中SYBR qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，DNA模板2 μL，去離子水補足至20 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。

1.2.4 引物特異性的驗證

分別提取隨機抽查的市售樣品1、樣品2、樣品3及自制益生菌發酵乳(干酪乳桿菌LTL1361、羅伊氏乳桿菌LTR1318及傳統發酵劑發酵)的DNA作為PCR反應模板，利用1.2.2中設計合成的種屬特異性引物進行PCR擴增，普通PCR反應體系和反應條件均按照1.2.3中所述條件進行，同時將擴增得到的PCR產物使用質量濃度10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 干酪乳桿菌LTL1361、羅伊氏乳桿菌LTR1318的16S rDNA基因克隆

采用細菌DNA提取試劑盒分別提取干酪乳桿菌LTL1361、羅伊氏乳桿菌LTR1318的基因組DNA。并以基因組DNA作為 PCR反應模板擴增，將擴增后的PCR反應產物純化后與pucm-T連接并轉化至DH5α感受態細胞，經過PCR鑒定并送去生工生物工程(上海)股份有限公司測序，檢測正確獲得的陽性克隆子分別命名為puc-LTL1361、LTR1318。

1.2.6 外標準品的制備及標準曲線的建立

分別提取質粒標準品puc-LTL1361、LTR1318 DNA，酶標儀測定A值后，按照公式(1)計算出拷貝數并做10倍系列稀釋，將不同濃度標準品作為模板進行熒光定量PCR反應：

(1)

式中：K，拷貝數，copies/mL；ρ，標準品濃度，g/mL；MW為相對分子質量，dolton。

以不同濃度標準品拷貝數的對數作為橫坐標，以熒光定量PCR反應過程中到達熒光閾值的初始循環數(Ct)為縱坐標繪制標準曲線，為待測樣品提供定量檢測參照標準。并通過使用曲線的斜率以及應用公式(2)來確定擴增效率：

(2)

式中，E表示擴增效率；slope表示斜率。

1.2.7 不同濃度益生菌的檢測

為驗證建立的熒光定量PCR檢測方法是否可以在實際樣品中進行檢測以及檢測結果的準確性，同時利用平板計數法和熒光定量PCR檢測方法對不同濃度益生菌進行檢測，并對分析結果進行比較。分別將干酪乳桿菌LTL1361和羅伊氏乳桿菌LTR1318培養至1010CFU/mL，再以10倍梯度法稀釋菌液濃度至1010～10 CFU/mL作為待檢樣品，每個樣品平行測定3次。

使用GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌計數》[24]對乳桿菌總數進行計數，參考RAVULA等[26]的方法使用LC瓊脂培養基對干酪乳桿菌計數，羅伊氏乳桿菌計數為兩者相減后所得。

熒光定量PCR檢測：分別提取不同濃度菌液核酸，并以該核酸為模板進行實時熒光定量PCR反應。

1.2.8 實際市售樣品的檢測

按建立的實時熒光定量PCR方法對隨機抽查的市售樣品進行檢測，每個樣品平行測定3次。同時對反應系統特異性及熒光定量PCR檢測時間進行分析。

1.3 數據與圖像處理方法

采用LightCycler?96 SW1.1軟件進行熒光定量PCR圖譜解析；采用GraphPad Prism 8用于統計學分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 質粒標準品的鑒定

構建的質粒標準品PCR鑒定結果見圖1。由圖1-a可知,泳道1、2分別在149 bp大小處得到單一條帶，其大小與目的片段相同；由圖1-b可知,泳道1、2分別在200 bp大小處得到單一條帶，其大小與目的片段相同；同時將puc-LTL1361、puc-LTR1318測序結果與目的片段基因序列對比，得到結果完全一致。上述結果表明：陽性克隆子puc-LTL1361及LTR1318構建成功，可用于后續實驗。

M-marker DL500；a：1和2-puc-LTL1361；b：1和2-LTR1318；a-puc-LTL1361標準品鑒定;b-puc-LTR1318標準品鑒定圖1 質粒標準品的PCR鑒定結果Fig.1 PCR identification results of plasmid standard

2.2 引物特異性驗證

如圖2所示，使用1.2.2中設計的干酪乳桿菌特異性引物對市售樣品進行PCR擴增，將擴增產物使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗。結果表明，泳道2、泳道3在149 bp處未出現特征條帶，結果顯示為陰性，表明樣品1、樣品2不含干酪乳桿菌；泳道4、泳道5分別在149 bp處出現特征條帶，與泳道6陽性對照一致，表明樣品3及泳道5自制益生菌發酵乳中含有干酪乳桿菌。根據樣品標簽信息標識：市售樣品1、樣品2中僅含嗜熱鏈球菌及保加利亞乳桿菌，樣品3含有干酪乳桿菌，自制益生菌發酵乳中含有干酪乳桿菌、羅伊氏乳桿菌及傳統發酵劑。使用該引物擴增，僅能特異性擴增出含有干酪乳桿菌基因片段樣品，說明引物特異性良好，能夠對樣品中的干酪乳桿菌準確定性檢測。

M-Marker DL500;1-陰性對照；2-樣品1; 3-樣品2; 4-樣品3;5-自制益生菌發酵乳；6-LTL1361圖2 樣品中干酪乳桿菌的定性檢測Fig.2 Qualitative detection of L. casei in samples

如圖3所示，使用1.2.2中設計的羅伊氏乳桿菌特異性引物對樣品進行PCR擴增，將擴增產物使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗。結果表明，泳道2、泳道3在200 bp處未出現特征條帶，結果顯示為陰性，表明樣品1、樣品2、樣品3中不含羅伊氏乳桿菌；泳道5在 200 bp大小處出現特征條帶，與泳道6陽性對照一致，表明泳道5自制益生菌發酵乳中含有羅伊氏乳桿菌。根據樣品標簽信息，使用該引物擴增，僅能特異性擴增出含有羅伊氏乳桿菌基因片段樣品，說明引物特異性良好，能夠對樣品中的羅伊氏乳桿菌準確定性檢測。

M-Marker DL500;1-陰性對照；2-樣品1；3-樣品2；4-樣品3；5-自制益生菌發酵乳；6-LTR1318圖3 樣品中羅伊氏乳桿菌的定性檢測Fig.3 Qualitative detection of L. reuteri in samples

2.3 標準曲線方程的建立

以不同濃度標準品拷貝數的對數作為橫坐標，以熒光定量PCR反應過程中到達熒光閾值的初始循環數(Ct)為縱坐標繪制標準曲線。其中，干酪乳桿菌標準曲線方程為：y=-3.264x+38.604，相關系數R2=0.995 9，擴增效率102%；羅伊氏乳桿菌標準曲線方程為：y=-3.363x+40.594，相關系數R2=0.995 7，擴增效率98%。上述結果表明,所建立的標準曲線方程，線性相關系數達到0.99以上，擴增效率在90%～110%，均符合實時熒光定量PCR的定量要求，可對待檢測樣品初始濃度進行精確定量。

2.4 不同濃度益生菌的檢測

利用熒光定量PCR檢測方法測定不同菌液Ct值并代入2.3所建標準曲線方程中計算得到PCR檢測結果，同時使用平板培養法對樣品進行計數，所得結果見表1。

表1 熒光定量PCR檢測結果與平板計數結果的比較Table 1 Comparison of fluorescence quantitative PCR test results and plate count results

由表1可知，當菌液濃度為10～104CFU/mL時，熒光定量PCR均沒有明顯的擴增信號，檢測結果記為陰性；當菌液濃度為104～108CFU/mL時，可測得Ct值計算拷貝數。將熒光定量PCR檢測結果與平板計數結果進行比較，檢測結果并無顯著性差異(P>0.05)，其結果對數值均在一個數量級上，與菌液實際濃度相符。以上結果表明，所建立的實時熒光定量PCR檢測方法檢測限為104CFU/mL,能夠滿足國標GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》中對發酵乳乳酸菌含量檢測的要求，并且所建立的熒光定量PCR檢測方法能夠準確反映益生菌含量。

2.5 市售樣品的定性、定量檢測

2.5.1 實時熒光定量PCR檢測結果分析

根據新建立的實時熒光定量PCR檢測方法對市售樣品進行檢測，通過觀察PCR擴增結果即可對樣品進行定性檢測。同時得到對應的樣品Ct值(y)，將其代入2.3中所建標準曲線方程計算，即可對樣品初始濃度(x)進行定量。所得結果見表2。

表2 市售樣品的實時熒光定量 PCR 檢測結果Table 2 Real-time fluorescence quantitative PCR test results of commercial samples

市售樣品1、樣品2在擴增時均沒有顯著熒光信號，無Ct值檢出，即無陽性擴增曲線形成，表明樣品中均不含有干酪乳桿菌及羅伊氏乳桿菌。樣品3中形成干酪乳桿菌陽性擴增曲線，同時檢出Ct值為12.02±0.22，將其代入干酪乳桿菌標準曲線方程y=-3.264x+38.604計算，得到干酪乳桿菌含量為(1.39±0.2)×109copies/mL。其中，樣品3并無羅伊氏乳桿菌陽性擴增曲線形成，說明樣品3并未添加羅伊氏乳桿菌。自制益生菌發酵乳中分別形成干酪乳桿菌及羅伊氏乳桿菌陽性擴增曲線，同時檢出干酪乳桿菌Ct值為10.84±0.14，將其代入方程中計算得到干酪乳桿菌含量為(3.2±0.35)×109copies/mL。檢出羅伊氏乳桿菌Ct值為11.49±0.11，代入羅伊氏乳桿菌標準曲線方程y=-3.363x+40.594中計算，可得羅伊氏乳桿菌含量為(4.5±0.36)×109copies/mL。檢測結果均與樣品標簽中標識菌株種類及數量信息一致，同時與2.2中樣品定性檢測結果一致。由此可知，所建立的實時熒光定量PCR檢測方法能夠對益生菌發酵乳中干酪乳桿菌及羅伊氏乳桿菌同時定性、定量檢測。姜凱等[27-29]使用流式細胞術測定酸奶中的乳酸菌，單個樣品耗時40 min。但流式細胞術卻無法對乳酸菌進行特異性檢測，檢測結果可能包含了除乳酸菌以外的其他微生物。陳臣等[30]采用普通PCR方法結合瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析對發酵乳中植物乳桿菌進行檢測，操作方法繁瑣且不能對益生菌定量。而本技術對目的菌株構建質粒標準品，建立了益生菌標準曲線方程，通過選取目的菌株的特異性基因序列設計引物，使目的菌株能夠進行特異性擴增從而實現對混合發酵乳中特定益生菌的定性檢測，同時檢出樣品Ct值并代入方程中計算即可對益生菌進行定量檢測。所建方法不僅克服了流式細胞術和傳統平板法很難對發酵乳中同一菌屬乳酸菌特異性檢測的困難，還在普通PCR定性檢測的基礎上實現了對益生菌的定量檢測。

2.5.2 熒光定量PCR反應檢測系統的特異性分析

通過解讀擴增產物的溶解曲線可對熒光定量PCR反應檢測的特異性進行評價，不同擴增產物下的溶解曲線不同，可通過觀察溶解曲線排除引物二聚體等非特異性干擾[31]。由圖4可知,擴增產物的溶解曲線皆呈單一峰型且空白對照無起峰現象，表明定量體系特異性良好，所用引物及PCR反應條件都適合進行熒光定量PCR反應。

2.5.3 實時熒光定量PCR檢測時間統計

實時熒光定量PCR檢測時間統計見表3。采用實時熒光定量PCR技術對發酵乳中益生菌進行檢測。為有效提取樣品DNA，對發酵乳中乳蛋白及脂肪進行酶解處理，此過程需要時長為1 h。將處理后樣品使用細菌DNA提取試劑盒提取發酵乳中DNA作為PCR反應模板，提取時間通常為1 h。將得到的DNA作為PCR反應模板，按照1.2.3中確定的實時熒光定量PCR體系和反應程序使用PCR儀擴增檢測,需要時間約為1.5 h。因此，本方法的整個檢測過程所需時間一般約為3.5 h。而使用傳統平板培養法檢測乳酸菌所需時間長達2～3 d[32]，相比之下，實時熒光定量PCR檢測技術顯著提高了檢測效率。

圖4 實時熒光定量PCR溶解曲線Fig.4 Real-time fluorescence quantitative PCR dissolutioncurve

表3 實時熒光定量PCR檢測時間表Table 3 Real-time fluorescence quantitative PCRdetection schedule

3 結論

本研究通過干酪乳桿菌及羅伊氏乳桿菌種屬特異性引物進行擴增，建立了雙重實時熒光定量PCR檢測方法。其中，所建干酪乳桿菌標準曲線方程為：y=-3.264x+38.604，羅伊氏乳桿菌標準曲線方程為：y=-3.363x+40.594，相關系數R2均在0.99以上。使用傳統平板計數法對其驗證，發現2種檢測方法對菌液計數結果并無顯著性差異。對市售樣品進行隨機抽樣檢測，通過觀察擴增結果和檢測樣品Ct值即可對市售產品中干酪乳桿菌和羅伊氏乳桿菌的有無和含量進行定性和定量檢測，經過對比可知檢測結果與所知的益生菌種類及數量信息相符。因此，本研究所建立的技術方法能夠比較快速、準確地對益生菌發酵乳中的干酪乳桿菌及羅伊氏乳桿菌進行定性、定量檢測，對有關制品的質量檢測和控制具有一定的指導作用。