基于SPME-GC-MS技術分析曲霉型豆豉生產過程中的揮發性成分變化

李金林，萬亮，王維亞，黃麗，王筱蘭，涂宗財*

1(江西師范大學 國家淡水魚加工技術研發專業中心，江西 南昌，330022)2(南昌市食品藥品檢驗所 南昌市食品安全檢測與控制重點實驗室，江西 南昌，330012)3(江西師范大學 江西省淡水魚高值化利用工程技術研究中心，江西 南昌，330022)

豆豉是我國傳統發酵豆制品，營養豐富、風味獨特，被廣泛用于調味品[1]，是與日本納豆、印尼天培等齊名的世界著名發酵豆制品[2]。豆豉具有多種生理功能，如促消化[3]、降血壓[4]、抗氧化[5]、降血糖[6]等。根據發酵優勢微生物不同，可分為曲霉型、毛霉型、根霉型和細菌型豆豉，其中曲霉型豆豉生產在我國分布最廣，不同類型豆豉風味特征存在較大差異[1，7]。

我國豆豉生產以傳統工藝為主，多采用自然發酵，其風味、品質及功能受環境影響較大[3]。江西生產豆豉歷史悠久，最著名的屬“稻香園”豆豉。“稻香園”豆豉屬于曲霉型豆豉[8]，本課題組前期已對其微生物進行測序[9]，并篩選獲得了高產脂肪酶米曲霉[10]和高產蛋白酶[11]、產乳酸[12]及高產酒精[13]菌株，但對該型豆豉的風味尚未進行報道。本文采用固相微萃取裝置(solid phase micro-extraction,SPME)進行風味物質萃取，采用氣相色譜-質譜聯用技術(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)進行成分分析，研究自然發酵曲霉型豆豉生產過程中風味物質變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料樣品,南昌稻香園調味食品有限公司采集。香精標品、系列正烷烴(C8-C40)混合標品,西格瑪(上海)公司。

1.2 儀器與設備

固相微萃取裝置(SPME)及萃取頭(DVB/CAR/PDMS、PDMS/DVB、Carboxen/PDMS、PDMS型),美國Supelco公司；7890A /5975氣相色譜-質譜聯用儀,美國Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集與處理

豆豉生產流程：

黑豆→洗滌→蒸煮→冷卻→自然制曲(內部溫度：20～30 ℃，空氣濕度：60%～90%，8 d)→洗曲→后酵(內部溫度：40～50 ℃，20 d)→熱風干燥(65～75 ℃，3～4 h)→包裝。

分別采集1個生產周期內制曲第8天、后酵第20天和干燥后的樣品(水分含量分別為22.97%、40.90%和19.19%)，用無菌袋封裝置于冰箱4 ℃冷藏，成分分析前粉碎過20目篩。

1.3.2 揮發性成分萃取

參照李金林等[14]方法進行，略有調整。取3 g樣品，加入到15 mL樣品瓶中，置于水浴中，采用恒溫裝置加熱，60 ℃平衡20 min，將SPME裝置置于樣品瓶上方，60 ℃恒溫萃取30 min，采用GC-MS分析。

1.3.3 氣相色譜-質譜條件

色譜條件：Agilent DB-wax毛細管柱(30 m×0.25 μm×0.25 μm)；進樣口溫度250 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min，不分流模式；升溫程序：起始40 ℃，保持3 min，4 ℃/min升至105 ℃，5 ℃/min升至150 ℃，10 ℃/min升至240 ℃，保持15 min[15]。

質譜條件：EI電離源，電離電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃；全掃描模式，質量掃描范圍35～400 amu。

1.3.4 線性保留指數(linear retention index,LRI)測定

采用樣品GC-MS分析條件進行C8-C40正烷烴混合標品分析，根據公式(1)計算LRI[16]：

(1)

式中：n,正烷烴的碳數；ti,目標成分保留時間，min；tn,Cn的保留時間；tn+1,Cn+1的保留時間。

1.3.5 揮發性成分鑒定與含量計算

將各組分質譜信息與NIST08 質譜庫進行對照，將各組分LRI與NIST數據庫比較,初步確定各組分成分，部分組分采用標品進行確認，以質譜峰面積考察各組分相對含量[15，17]。

2 結果與分析

2.1 固相萃取頭的選擇

以干豆豉為原料，采用4種萃取頭萃取豆豉揮發性成分，采用GC-MS分析，經自帶軟件AMDIS 32及NIST08數據庫進行解析，4種萃取頭所萃取的成分GC-MS色譜圖見圖1，解析結果見表1。

圖1 四種萃取頭所萃取成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of flavor compounds extracted by SPME with four fibers

SPME是根據相似相溶原理，通過萃取頭的吸附性從樣品中萃取揮發性物質，萃取頭極性不同所萃取的物質不同。本研究中PDMS為弱極性萃取頭，適用于弱極性物質萃取，另外3種屬中等極性萃取頭，適用于中等極性與極性化合物萃取[18]。由圖1可知，PDMS萃取頭萃取的成分種類少、信號強度弱，表明豆豉極性成分占比高。對比色譜圖解析結果(表1)，Carboxen/PDMS萃取物質的最大峰面積最大，但僅個別成分含量高(圖1)，且經解析的目標成分數不如DVB/CAR/PDMS和PDMS/DVB多。PDMS/DVB在最大峰面積、解析的總化合物數和目標成分數均優于DVB/CAR/PDMS和PDMS，表明PDMS/DVB更適合豆豉風味物質萃取，用于后續分析用萃取頭。

表1 四種萃取頭所萃取成分的GC-MS分析結果Table 1 Automated mass spectral deconvolution andidentification results of GC-MS TIC of flavor compoundsextracted by four fibers

2.2 豆豉生產三階段揮發性成分鑒定

豆豉生產大致分為三階段，即制曲、后酵和干燥。三階段樣品揮發性成分經SPME萃取，采用GC-MS鑒定，結果見表2。由表2可知，制曲階段共檢出24種成分，依次是呋喃1種、吡嗪5種、醛4種、醇3種、酮2種、酸2種、酚4種、其他3種。后酵階段豆豉中共檢出45種成分，包括呋喃3種、吡嗪4種、醛7種、醇5種、酮2種、酸4種、酯11種、硫化物2種、酚5種、其他2種。干豆豉中共鑒定出50種物質，分別是呋喃3種、吡嗪6種、醛7種、醇7種、酮2種、酸4種、酯11種、硫化物2種、酚5種、其他3種。

2.3 不同生產階段揮發性成分對比分析

在生產過程中發現，原料黑豆有股青味，蒸煮后的黑豆主要呈現豆腥味，經制曲后豆腥味消失，可嗅出淡淡的醬香味，經后酵后形成了濃郁的醬香味和醇香味，干燥后豆豉的醬香味依然濃郁，而醇香味減淡。制曲、后酵及干燥三階段揮發性物質種類、數量及含量變化情況見圖2。

圖2 豆豉生產三階段揮發性物質種類、數量及含量變化情況Fig.2 Changes in species,amount,and content of volatilecompounds in Douchi during three processes

通過分析發現，在制曲階段，形成了少量的揮發性物質，主要為醇、酚、醛，含量分別占總揮發物的23.54%、20.83%和18.48%，醇、醛賦予豆豉甜香、堅果香和面包香等有益風味(表2)，這2類物質可通過美拉德反應和脂肪氧化形成[16，19]；酚主要為愈創木酚，其是木質素的結構單元，可能來源于木質素的降解[20]，其賦予了豆豉木香、酚味、煙熏等風味。另外，制曲后形成了少量的吡嗪、呋喃、酮類和酸類物質，吡嗪和呋喃是典型的美拉德反應產物[15]，表明制曲階段已經發生了輕度的美拉德反應。

經過后酵，豆豉形成了大量的揮發性物質，醛、酯、醇和酚是含量最高的4類成分，其含量之和超過90%。后酵豆豉中檢出26種新成分(表2)，包括2,6-二甲基吡嗪、5-甲基糠醛、可可醛、二甲基三硫和3-甲基硫醇等典型風味物質。酯類是后酵過程中形成最多的一類物質，共11種，約占總風味物質的25.40%。酯類的形成賦予產品甜香、花香、水果香、脂香等良好風味。新檢出的2種硫化物總含量為1.17%，雖然較低，但其氣味閾值低，如二甲基三硫為0.36 μg/L[21]，對整體風味可產生一定影響。另外，2,6-二甲基吡嗪、可卡醛、1-辛烯-3-醇等8種成分含量明顯增加，其中可卡醛增加最大，其峰面積由制曲階段的(4.28±0.97)×104增長至(224.67±12.74)×104，是后酵豆豉中含量最高的成分。可卡醛具有甜香、花香、堅果香、可可香等良好風味，其他物質均體現令人愉快的風味(表2)，因此這些物質含量的增加有利于改善了豆豉風味。

經熱風干燥后，豆豉揮發性成分發生了微弱變化，含量最高的4類物質依次為醛、酯、酚和醇，總量占總風味物質含量的87.24%，檢出2,6-二乙基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、1,2-丙二醇等5種新成分，沒有檢出異丁酸，其他成分含量變化不大。采用SPME萃取風味成分，萃取效果不僅與萃取頭極性、萃取溫度及時間有關，也與鹽分含量有關[18]。因此，干豆豉與濕豆豉的揮發性不同可能是由樣品鹽含量不同造成的。另外，在干燥過程中由于豆豉表層及沸點較低的物質揮發，豆豉中各成分的相對含量也會發生改變。由于多數物質呈現的風味特征相近(表2)，微小含量的改變并未影響豆豉的整體風味。

表2 豆豉生產不同階段樣品揮發性成分(n=2)Table 2 Flavor compounds identified in samples from different process of Douchi production(n=2)

續表2

3 結 論

由本實驗可知，PDMS/DVB萃取頭適用于豆豉揮發性成分的萃取，表明豆豉中主要含極性成分，成分鑒定顯示，豆豉中主要含有呋喃、吡嗪、醛、醇、酮、酸、酯、硫化物、酚等物質，進一步論證了豆豉風味物質中極性成分占主體。煮熟的黑豆風味較淡，豆豉中豐富的風味物質是在生產過程中經微生物代謝及食物組分的相互作用形成的。前期研究已從豆曲或后酵豆豉中分離出了產蛋白酶、脂肪酶、乳酸及乙醇等物質的菌株[10-13]，蛋白酶、脂肪酶等酶的產生促進大豆形成氨基酸、脂肪酸等風味前體物質，分離出產乳酸、乙醇的菌株表明微生物代謝可直接形成風味物質。豆豉中揮發性成分的種類、含量與微生物多樣性及發酵條件有關。前期研究表明[9]，制曲與后酵階段微生物存在差異，制曲階段米曲霉屬(Aspergillus)為第一大優勢真菌，葡萄球菌屬(Staphylococcus)為第一大優勢細菌；后酵階段米曲霉屬相對豐度不斷下降，橫梗霉屬(Lichtheimia)成為第一大優勢真菌；細菌中魏斯氏菌屬(Weissella)相對豐度不斷增加，最終與葡萄球菌屬(Staphylococcus)共同成為優勢細菌，其他菌屬微生物在2個階段也存在一定差異。因此，微生物多樣性導致了制曲和后酵階段形成的揮發性成分存在差異。另一方面，發酵溫度與時間不同也可能影響風味物質的形成，制曲階段溫度接近環境溫度(20～30 ℃)，時間較短(8 d)，后酵階段由于堆積及微生物代謝發熱，溫度維持在40～50 ℃，發酵時間為20 d，溫度的適度提高及時間延長有利于美拉德、脂肪氧化等熱反應發生以形成良好的風味物質[22]。干燥階段，溫度控制在65～75 ℃，先高后低，由于干燥時間較短(3～4 h)，干豆豉中揮發性成分種類相對于濕豆豉變化不大，但含量發生一定變化，原因可能是隨著水分的蒸發，豆豉表層及沸點低的成分也隨之揮發。在干豆豉中檢出5種新成分，推測熱風干燥可能促進新物質形成。總之，無論是從風味成分形成的數量還是含量看，后酵是豆豉風味物質形成的主要階段。由于豆豉風味的形成是微生物代謝及食物組分相互作用的結果，其各風味物質形成的機理還需進一步探討。