膜修飾傳感器檢測扒雞煮制老湯中鮮味氨基酸的樣品處理

薄存美，劉登勇,2*，王笑丹，張慶永

1(渤海大學 食品科學與工程學院,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧 錦州， 121013)2(江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京， 210095)3(吉林大學 食品科學與工程學院，吉林 長春， 130062) 4(山東德州扒雞股份有限公司，山東 德州， 253003)

醬鹵肉制品是指將鮮(凍)畜禽肉放入含有食鹽、醬油以及香辛料的水中，經調味、煮制等工藝加工而成的一類熟肉類制品[1]，代表性產品主要有燒雞[2]、醬牛肉[3-4]、鹽水鴨[5]、醬豬蹄、醬豬肘[6]以及紅燒肉[7]等，因其鮮香馥郁、鮮美可口的特點而深受消費者喜歡。醬鹵肉制品老湯對產品滋味影響重大，是決定醬鹵肉制品品質的重要因素[8]。

老湯在連續煮制過程中會不斷累積可溶性滋味物質，其中咸味和鮮味是老湯對產品最主要的滋味貢獻，因此實現咸味和鮮味物質含量的實時監測對產品的標準化與穩定性至關重要。咸味大多使用硝酸鹽滴定法進行實時監測[9]；鮮味主要來源于老湯煮制過程的肉類降解產物，包括多肽類、核苷酸類、氨基酸類、有機酸等[10]，其中鮮味氨基酸和鮮味核苷酸是老湯中最具代表性的兩類鮮味成分，包括谷氨酸、天冬氨酸、5′-肌苷酸和5′-鳥苷酸[11-13]等，鮮味氨基酸大多通過氨基酸分析儀[14]、液相色譜法[15]、毛細管電泳法[16]和氣相色譜法[17]等常規方法檢測，存在設備成本高、樣品前處理復雜、定性能力差等問題。目前電化學傳感器檢測逐漸成為新的研究趨勢，利用物質在溶液中的反應引起一系列電化學反應的性質，通過反應所產生的電勢差實現物質的檢測，具有安全、靈敏度高、穩定性和可選擇性強等優點[18-19]。本課題組前期研究發現，N，N′-二苯基硫脲(N,N′-diphenyl thiourea,DPTU)可作為鮮味敏感物質應用于電化學傳感器特異性檢測鮮味氨基酸[20]，但尚未就其在實際樣品的標準化檢測應用方面開展系統研究。實現老湯鮮味氨基酸電化學快速、準確檢測，必須滿足樣品檢測參數標準化的要求，一套合適且固定的樣品檢測參數不僅有利于提高檢測結果的準確性和穩定性，而且可以提高其檢測效率。老湯成分復雜，過多的干擾物質會影響結果的準確性，離心是去除測定干擾的有效方法，且老湯中鮮味氨基酸含量較高，實際檢測樣品中鮮味氨基酸含量超過傳感器的檢測最高限，因此需要通過稀釋以達到DPTU膜修飾傳感器的檢測限度。基于此，本文以扒雞煮制老湯為研究對象，并以液相色譜檢測結果為標準，研究適于N，N′-二苯基硫脲膜修飾傳感器快速、準確檢測鮮味氨基酸含量的樣品前處理方式。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

材料：扒雞老湯，由山東德州扒雞股份有限公司提供。

試劑：異硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate,PITC)、三乙胺、無水乙酸鈉、正己烷、冰乙酸、濃H2SO4、H2O2、正己烷、四氫呋喃、鄰苯二甲酸二辛酯、聚氯乙烯、DPTU為國產分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司；谷氨酸、天冬氨酸為標準品(純度>99%)，北京索萊寶科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設備

CHI660E電化學工作站，北京壯仕科技有限公司；LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津儀器公司；Allegra 64R冷凍離心機，美國Beckman公司；AL104電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；鉑盤電極、鉑絲電極、232型飽和甘汞電極，上海楚兮實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 液相色譜檢測

標準工作溶液的配置：準確稱取谷氨酸、天冬氨酸各10.00 mg，用去離子水定容至10 mL的容量瓶中，超聲至完全溶解，得(1+1)mg/mL的谷氨酸-天冬氨酸混合標準溶液，4 ℃保存。用去離子水稀釋成質量濃度為12.5、25、50、100、150、200、250 μg/mL的混合標準系列梯度溶液。

老湯樣品前處理方法：扒雞老湯(除去浮于表層的油脂)→過濾(除去香辛料碎渣、肉末等大塊固形物)→離心→取2 mL上清液→定容至10 mL。

衍生：參照芮鴻飛等[21]的方法并稍作修改。取500 μL上述稀釋后的老湯樣品，置于4 mL的塑料試管中，再分別加入異硫氰酸苯酯-乙腈溶液、三乙胺-乙腈溶液各250 μL，將其充分混勻后在室溫下放置30 min，加入50 μL的乙酸溶液充分混勻，隨后向衍生完畢的溶液中加入1 mL的正己烷溶液，用漩渦振蕩儀振蕩60 s，萃取掉剩余的衍生試劑后，靜置10 min分層，棄去上層正己烷溶液，用5 mL的注射器吸取出下層清液，經0.45 μm的有機濾膜過濾打入2 mL的液相色譜頂空瓶內，用于液相色譜儀的檢測。

色譜條件：色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)； 柱溫40 ℃； 檢測波長254 nm；流速1 mL/min； 流動相A為乙酸鈉溶液，流動相B為80%乙腈溶液；流動相洗脫程序：0 min，A 92%；B 8%；2 min，A 92%；B 8%；10 min，A 90%；B 10%。

1.2.2 電極預處理

電極預處理參考朱靈濤[20]的方法。鉑盤電極預處理時，首先用5 000目砂紙打磨電極，直至表面光滑，用去離子水清洗干凈表面，自然晾干，隨后在拋光絨布上依次用300、50和10 nm的Al2O3拋光粉對鉑盤表面進行拋光，拋光結束后，將鉑盤電極浸泡于Piranha溶液中[V(濃H2SO4)∶V(30% H2O2)=3∶1]，超聲清洗5 min，隨后放入去離子水中再超聲清洗5 min，電極清洗完畢后，自然晾干，避光無塵保存備用。飽和甘汞電極無需過多的預處理，但新購買的飽和甘汞電極在試驗前需要先確定電極內是否充滿飽和KCl溶液，并有少許飽和KCl晶體存在，否則需要重新選擇飽和甘汞電極。鉑絲電極在試驗前的預處理流程與鉑盤電極類似，需要事先將鉑絲電極分別浸泡于Piranha溶液及去離子水中超聲清洗5 min后備用，目的是除去鉑絲表面的雜質。由鉑盤電極、鉑絲電極和飽和甘汞電極構建三電極體系，并進行后續的電化學試驗。

1.2.3 膜修飾傳感器的制備

參照朱靈濤[20]的方法并稍作修改，含有鮮味氨基酸敏感物質的膜溶液組成為：四氫呋喃5 mL，鄰苯二甲酸二辛酯0.50 mL，聚氯乙烯0.08 g，DPTU 0.095 g。采用直接滴涂法，用移液槍準確吸取10 μL膜溶液滴涂于鉑盤電極表面，自然晾干后備用。

1.2.4 標準溶液的配制

準確稱取谷氨酸、天冬氨酸各14.70、13.30 mg，用去離子水分別定容至100 mL，超聲至完全溶解，得到1 mmol/L的谷氨酸和天冬氨酸標準溶液，4 ℃保存。

1.2.5 電化學傳感器檢測流程

扒雞老湯(除去浮于表層的油脂)→過濾(除去香辛料碎渣、肉末等大塊固形物)→取20 mL，離心→取5 mL上清液→定容至100 mL→攪拌(磁力攪拌，1 h)→電化學檢測

本試驗采用開路電位法進行電化學檢測，參數設置為穩定時間：60 s；檢測時間：60 s；檢測間隔：0.1 s；高電位：+1.0 V，低電位：-1.0 V。

1.2.6 離心力對傳感器檢測結果的影響

離心力分別定為8 000、10 000、11 000、12 000、13 000、14 000、16 000×g，每組老湯樣品設置3個平行。其他試驗參數分別為離心時間20 min；稀釋倍數為20；攪拌時間1 h；分析樣本20 mL。

1.2.7 離心時間對傳感器檢測結果的影響

本試驗中離心時間分別為10、15、20、25、30 min，每組老湯樣品設置3個平行試驗。其他試驗參數分別為離心力13 000×g；稀釋倍數為20；攪拌時間1 h；分析樣本20 mL。

1.2.8 樣品稀釋倍數對傳感器檢測結果的影響

用去離子水對老湯分別進行10、15、20、25、30倍稀釋后檢測，其他試驗參數分別為離心時間20 min；離心力13 000×g；攪拌時間1 h；分析樣本20 mL，試驗中結果的對比數據為檢測相對應的同一條件下處理的樣品。

1.3 數據處理

本試驗采用SPSS 19.0 軟件中的單因素方差分析(One-Way ANOVA)法對試驗結果進行處理，顯著性水平為 0.05，每個試驗指標至少重復測定3次，傳感器檢測試驗結果采用測定數據與液相色譜檢測結果之間比較其偏差程度(%)。作圖采用Origin 2017軟件。

2 結果與分析

2.1 采用液相色譜儀檢測鮮味氨基酸時標準溶液的線性關系

將7個不同質量濃度梯度 (12.5、25、50、100、150、200、250 μg/mL) 的混合氨基酸標準溶液分別進行檢測,用各個氨基酸液相分析對應的峰面積對其相應的質量濃度 (單位μg/L) 進行回歸分析(圖1)。

a-谷氨酸;b-天冬氨酸圖1 液相色譜檢測谷氨酸、天冬氨酸的濃度-峰面積線性回歸圖Fig.1 Linear regression plot of concentration-peak area forglutamic acid and aspartic acid detected by liquidchromatography

結果表明，天冬氨酸和谷氨酸均在12.5～250 μg/mL的濃度范圍內具有較好的線性關系，其濃度與峰面積的線性關系分別為Y1=37 914X1-371 973、Y2=11 126X2-138 346，相關系數R2分別為0.994 0、0.993 7。

2.2 液相色譜儀對扒雞老湯鮮味氨基酸的檢測結果

2種鮮味氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)的高效液相色譜檢測結果顯示：老湯中鮮味氨基酸總含量為699.48 μg/mL(5.12 mmol/L)，含量的RSD在5.0%以內，表明該方法重復性良好，所建立的分析方法穩定，可用于后續的試驗。王南[22]采用氨基酸分析儀對老湯中的鮮味氨基酸進行檢測，含量為70.30 mg/100 g(約為4.72 mmol/L)，檢測結果波動變化，但差異較小，差異的原因一方面取決于其原料肉中氨基酸形成和降解的比率，另一方面也取決于濃度差的作用，導致肉湯間的相互滲透存在差異[23]。

2.3 傳感器響應信號分析

采用開路電位法對傳感器的響應信號進行分析，傳感器在氨基酸標準品溶液(以10-3mol/L的谷氨酸標準品為例)和老湯稀釋液(以老湯稀釋1∶10倍為例)中的響應信號圖如圖2所示。

a-氨基酸標準品溶液;b-老湯稀釋液圖2 DPTU膜修飾傳感器的響應信號圖Fig.2 Response signal of DPTU film modified sensors

0～10 s內DPTU膜修飾傳感器的響應信號急劇變化，電化學信號不穩定，易受外界條件影響而產生波動；10.1～60 s內電化學信號強度已趨于穩定，60.1～120 s電化學信號基本無變化。因此，為了避免儀器、環境以及人為操作等的干擾,以及提高試驗效率，本試驗縮短檢測時間為60 s，并提取10.1～60 s的平均值作為一次電化學傳感器檢測信號值，單位為V進行數據分析。

2.4 傳感器檢測標準曲線線性范圍的確定及線性擬合

如圖3所示，谷氨酸和天冬氨酸均可配置成濃度較低的溶液，通過對-7.5～-3 lg(mol/L)的10個濃度梯度的鮮味氨基酸標準品進行傳感器檢測，確定鮮味氨基酸在-6～-3 lg(mol/L)的范圍內線性良好。在10-6～10-3mol/L濃度范圍內對鮮味氨基酸的濃度梯度與電化學檢測電信號的關系進行曲線擬合，擬合后的函數關系如公式(1)所示：

Ocp混合=0.049 81 lgc+0.271 6

(1)

式中:Ocp,開路電位法電位值,V;lgc,鮮味氨基酸濃度對數,mol/L。

圖3 膜修飾傳感器在不同濃度鮮味氨基酸溶液的電位值變化關系圖Fig.3 Variation of potential value of film modified sensors atdifferent concentrations of umami amino acid solution

2.5 離心力對傳感器檢測扒雞老湯中鮮味氨基酸濃度的影響

圖4顯示，離心力在8 000～12 000×g，鮮味氨基酸的傳感器檢測值呈緩慢增加的趨勢，繼續增加離心力，傳感器檢測結果基本保持不變，原因可能是膜修飾鉑盤電極的電催化氧化過程存在干擾物的毒化特性[24-25]。當離心力過小時，老湯樣品中殘留的干擾物質無法去除，造成電極的毒化，從而對試驗結果產生干擾；隨著離心力的增加，脂肪以及小分子蛋白質等干擾物質逐漸被離心沉淀，毒化作用減弱，從而使鮮味氨基酸的檢測值與實際值接近。與液相色譜儀檢測結果相比，當離心力為8 000、10 000、11 000、12 000、13 000、14 000、16 000×g時，傳感器檢測結果的偏離程度分別為11.79%、8.01%、7.42%、5.27%、3.13%、7.2%和6.25%。當離心力為13 000×g時，傳感器檢測結果的偏離程度最低，與液相色譜儀檢測結果最接近，因此選擇13 000×g為最佳離心力條件。

圖4 不同離心力條件下DPTU膜修飾傳感器檢測鮮味氨基酸濃度Fig.4 DPTU film modified sensors for detecting umami aminoacid content under different centrifugation force注：不同小寫字母表示差異顯著(下同)

2.6 離心時間對傳感器檢測扒雞老湯中鮮味氨基酸濃度的影響

從圖5可知，離心時間在10～15 min，鮮味氨基酸的傳感器檢測值呈緩慢增加的趨勢，繼續增加離心時間，傳感器檢測結果基本保持不變。原因可能是當離心時間過短時，老湯樣品中的小分子蛋白質等可能與鮮味氨基酸緊密結合，從而對DPTU吸附鮮味氨基酸的反應形成競爭，導致鮮味氨基酸無法完全與DPTU結合，隨著離心時間的增加，干擾成分已基本去除，從而使鮮味氨基酸的檢測值與實際值相近；另一個原因可能是溶液中的鮮味氨基酸未完全解離，未解離形式的氨基酸由于不能將與DPTU結合的作用位點暴露[26]，從而導致傳感器信號的偏移。離心時間在10～30 min時，傳感器測定數據與液相色譜檢測結果之間的偏差程度分別為14.65%、6.64%、2.75%、5.86%和8.98%，在20 min時，傳感器檢測結果的偏離程度最低，與液相色譜儀檢測結果最接近，因此選擇20 min為離心時間。

圖5 不同離心時間條件下DPTU膜修飾傳感器檢測鮮味氨基酸濃度Fig.5 DPTU film modified sensors for detecting umami aminoacid content under different centrifugation time

2.7 老湯稀釋倍數對傳感器檢測扒雞老湯中鮮味氨基酸濃度的影響

溶于老湯體系中的鮮味氨基酸在溶液中發生解離，暴露出與鮮味敏感物質DPTU結合的作用位點[20]。在一定的檢測范圍內，浸出液中呈味物質濃度[27]和離子活度的差異[28-29]會直接影響傳感器的響應信號。由圖6可知，稀釋倍數為10～20倍時，檢測結果的差異不顯著(P>0.05)，隨著稀釋倍數的增加差異顯著增加(P<0.05)，不同稀釋倍數條件下檢測結果的偏離程度分別為7.29%、3.78%、3.03%、12.19%和19.96%。原因可能是不同稀釋倍數條件下鮮味氨基酸的離子活度存在差異，稀釋倍數越高，檢測結果的偏離程度越高，稀釋倍數越低，檢測結果越接近液相色譜檢測結果。隨著老湯逐漸稀釋，老湯中濃度較高的更多的干擾物質逐漸被稀釋，達到傳感器檢測的濃度范圍，引起電化學信號的偏移，從而使鮮味氨基酸含量的檢測結果發生偏移。楊昌偉等[30]選用Roche E601電化學發光法研究了2、4、8、16、32不同稀釋倍數對β-HCG檢測結果的影響，結果發現，稀釋倍數越高，檢測的準確率越低，而一次性檢出率越高，說明隨著稀釋倍數的增加，產生的誤差增大，準確率越低。當稀釋倍數為20倍時，傳感器檢測結果的偏離程度最低，結果最準確，因此試驗確定最佳稀釋倍數為20倍。

圖6 不同老湯稀釋倍數條件下DPTU膜修飾傳感器檢測鮮味氨基酸濃度Fig.6 DPTU film modified sensors for detecting umami aminoacid content under different dilution ratio of brine

3 結論

本研究探討了N，N′-二苯基硫脲膜修飾傳感器檢測扒雞煮制老湯的最佳樣品前處理方式，當離心力為13 000×g、離心時間為20 min及老湯稀釋倍數為20倍時，N，N′-二苯基硫脲膜修飾的傳感器檢測鮮味氨基酸含量的結果最為準確。利用N，N′-二苯基硫脲膜修飾的傳感器檢測醬鹵老湯中鮮味氨基酸含量的方法是可行的，且比常規檢測方法更為簡便易行、快速、節約成本，可以用于生產實際。