蘋果酸-乳酸發酵中乳酸菌的分離及其對葡萄酒香氣成分的影響

張煜晨，張丹丹，林可，王斌，程衛東，史學偉

(石河子大學 食品學院，新疆 石河子，832000)

近幾年，新疆的葡萄酒產業發展迅猛，逐漸形成了伊犁河谷、天山北麓、吐哈盆地及焉耆盆地四大優勢產區[1]。赤霞珠(Cabernet Sauvignon)釀酒葡萄起源于法國，是波爾多釀造紅葡萄酒的傳統品種，也是世界上種植面積最廣的釀酒葡萄品種[2]。作為生產優質干紅葡萄酒的主要原料，赤霞珠葡萄在新疆的許多釀酒葡萄地區種植。高品質葡萄酒的發酵一般需要經歷酒精發酵和蘋果酸-乳酸發酵(malolactic fermentation,MLF)過程。MLF是繼酒精發酵后，葡萄酒中L-蘋果酸在乳酸菌的蘋果酸-乳酸酶催化下轉變成L-乳酸和CO2的過程[3]。

在葡萄酒中啟動并進行MLF過程的乳酸菌稱為葡萄酒乳酸菌，主要包括4個屬的多個種，如酒酒球菌、植物乳桿菌、瑞士乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌和副干酪乳桿菌等[4]。MLF過程中，乳酸菌能夠代謝多種物質，一方面為自身的生長繁殖提供了營養和能量來源；另一方面其代謝產物賦予葡萄酒豐富的香氣，提升了葡萄酒的品質[5]。葡萄酒在MLF過程中產生了乙酸、乙酸酯、高級醇、羰基化合物和脂肪酸等多種揮發性化合物[6-7]，賦予葡萄酒果味[8]和黃油氣味[9]等。此外，紅葡萄酒、部分白葡萄酒以及起泡葡萄酒都依賴于MLF來提升葡萄酒的品質[10]。然而，商業乳酸菌發酵劑在葡萄酒發酵過程中的應用，使得葡萄酒同質化現象較為嚴重，難以體現不同葡萄酒產區的區域特色。

新疆的釀酒葡萄因獨特的地理氣候而獨具特色(例如“高糖低酸”)[11]，本研究以新疆天山北麓產區赤霞珠葡萄酒自然MLF過程中分離的乳酸菌為發酵劑啟動MLF過程，監測其發酵過程中理化指標和揮發性香氣物質的變化，考察乳酸菌在MLF過程中對葡萄酒品質的影響，為地方區域優質乳酸菌在MLF中的應用奠定理論基礎，為葡萄酒品質控制和發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒發酵液：2018年10月取自張裕巴堡男爵酒莊(中國新疆)結束酒精發酵的赤霞珠葡萄酒。其中，殘糖3.82 g/L，總酸6.56 g/L,pH 3.59,酒精度11.7%vol。

商業菌株S1(Lactoenos450PreAc)，法國LAFFORT公司；MRS培養基，青島高科技工業園海博生物技術有限公司；內標物2-甲基戊酸，上海源葉生物科技有限公司；蘋果酸標品、乳酸標品，北京萬佳首化生物科技有限公司；細菌DNA提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

DYY-8C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；T100 梯度PCR儀，美國Bio-rad公司；LC-2900 高效液相色譜儀，上海天普分析儀器有限公司；SAX強陰離子固相萃取柱(1 000 mg，6 mL)，冠森生物科技(上海)有限公司；7890B系列氣相色譜儀和配備MSD選擇性檢測器的安捷倫5977A質譜儀(配備HP-InnOAVx毛細管柱)，美國Aligent公司。

1.3 乳酸菌的分離鑒定

從張裕巴堡男爵酒莊收集結束酒精發酵的赤霞珠葡萄酒發酵液于密閉玻璃容器中，于25 ℃培養箱中恒溫放置，進行自然MLF過程。每隔4 d定期取樣，共取5次。取出的樣品經102倍稀釋搖勻后，均勻涂布于MRS培養基上，分離純化得到純培養物，經顯微鏡形態觀察和革蘭氏染色觀察進行初步鑒定。以通用引物擴增菌株的16S rDNA序列，并在NCBI數據庫中進行比對。將同源性較大的已知菌株與未知菌株的16S rDNA序列用MEGA軟件以鄰近法構建系統發育樹，明確未知菌株的種屬關系。

1.4 MLF

取張裕巴堡男爵酒莊經酒精發酵后的赤霞珠葡萄酒發酵液，用0.45 μm水系膜對葡萄酒發酵液進行過濾除菌，過濾之后的發酵液在4 ℃下短期貯藏，用作MLF原料。將分離得到的3株乳酸菌和1株商業菌株S1接種到MRS液體培養基中活化，待培養至對數生長期，以107CFU/mL的接種量接到裝有100 mL過濾除菌的葡萄發酵液三角瓶中，在25 ℃培養箱中進行MLF過程。測定蘋果酸含量變化(參照GB 5009.157—2016)，以蘋果酸質量濃度為標準，當蘋果酸質量濃度<0.5 g/L時，結束發酵。之后取樣收集，8 000 r/min離心10 min，取上清液，用于分析葡萄發酵液中理化指標和揮發性香氣物質。以不添加任何菌株作為空白對照，與實驗組一起放置于相同條件下并取樣。

1.5 理化指標檢測

采用斐林試劑滴定法(參照GB/T 15038—2006)測定殘糖含量；通過酸堿滴定法(參照GB/T 15038—2006)測定MLF前后的總酸含量變化；采用pH計測定MLF前后的pH變化；利用酒精計法(參照GB 5009. 225—2016)測定樣品中的酒精度；根據碘滴定法(參照GB/T 15038—2006)測定SO2的含量；通過高效液相色譜法測定蘋果酸和乳酸含量變化(參照GB 5009.157—2016)。

綜上所述，酚咖片聯合甲硝唑治療口腔正畸牙痛患者可降低血清OPG水平，促進分泌5-HT，減輕牙痛程度，臨床效果顯著。

1.6 揮發性香氣物質

采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)法提取葡萄酒中的揮發性香氣成分，并用氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)法進行分析[14]。在HS-SPME提取之前，葡萄酒樣品在密閉條件下8 000 r/min離心10 min，使細菌和雜質沉淀。將5 mL離心后的葡萄酒樣品、1 g NaCl和2 μL體積分數0.98% 2-甲基戊酸加到15 mL樣品瓶中，混合均勻后放入1顆磁力攪拌轉子。然后用聚四氟乙烯表層的隔膜蓋密封小瓶。樣品放置在磁力攪拌器上，轉速300 r/min，40 ℃平衡10 min后，用50/30 μm(DVB/CAR/PDMS) 固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)的萃取頭對平衡后的樣品在40 ℃下連續加熱攪拌萃取60 min，萃取和富集發酵液中揮發性香氣物質。

使用配備HP-InnOAVx毛細管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)的安捷倫7890B系列氣相色譜儀和配備選擇性檢測器(MSD)的安捷倫5977A質譜儀對前面用HS-SPME萃取的揮發性芳香化合物進行解吸和分析。具體方法：通過將SPME萃取頭插入氣相色譜儀注射器中進行熱解吸，保持在250 ℃，然后在HP-InnOAVx毛細管柱上進行分離。升溫程序：50 ℃持續5 min，以3 ℃/min升至86 ℃，接著以1 ℃/min升至90 ℃，再以3 ℃/min升至180 ℃，保持3 min，最后以15 ℃/min升至230 ℃(5 min)。載氣(He)流速為1 mL/min。分離出的揮發性芳香化合物通過電子電離質譜法進行，在總離子電流(TiC)模式下操作，電離能為70 eV。采集范圍為m/z35～450。

定性定量分析：通過比較用質譜庫搜索(National Institute of Standards and Technology,NIST)獲得的光譜及資料分析鑒定提取的揮發性組分，并與文獻報道的保留指數(retention index，RI)相比較，或與同條件下該物質標準品的RI和MS圖像比較，以確定某物質。利用2-甲基戊酸內標法進行半定量分析。計算公式如下公式(1)所示：

(1)

式中：ρn,各香氣物質質量濃度,μg/L；ρ1,內標物質質量濃度,μg/L；Si,各組分峰面積；S0,內標物質峰面積。

1.7 感官評定

建立感官評定小組，由12位經過培訓的人員(6男6女，年齡范圍為22～30歲)組成，培訓標準根據ISO 13300-2-2006[13]制定，評定方法參考JACKSON[14]的感官環境和操作步驟進行，感官分析方法參考RUTAN等[15]的研究，根據實際情況建立對葡萄酒的呈香感官描述(表1)。評定方法為9分嗜好法[16]，0～9分表示風味逐漸增強，其中0分代表沒有被察覺，9分代表風味強度最大。每種發酵酒感官評定3次，取平均值。

表1 葡萄酒風味描述Table 1 Flavor descriptions of wine

1.8 數據分析

2 結果和分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

通過多次分離純化后，篩選到疑似乳酸菌18株，其中JN1、ZN3和GN9具有較強的蘋果酸降解能力。分離的乳酸菌在MRS培養基中生長狀況良好，單菌落較小，表面光滑、濕潤，呈乳白色，邊緣整齊；革蘭氏染色試驗呈陽性，顯微形態呈球狀和桿狀，均符合乳酸菌的基本生長特征及顯微特征。通過16S rDNA分析鑒定，在NCBI中經BLAST比對分析，構建系統發育樹，如圖1所示。

圖1 JN1、ZN3、GN9菌株系統發育樹Fig.1 JN1,ZN3,GN9 strain phylogenetic tree

菌株JN1和酒酒球菌(Oenococcusoeni)具有較高的同源性；菌株ZN3和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)具有較高的同源性；菌株GN9和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)具有較高的同源性。綜上所述，分離得到的3株乳酸菌分別為酒酒球菌JN1、植物乳桿菌ZN3和干酪乳桿菌GN9。

2.2 乳酸菌對葡萄酒理化指標的影響

為了考察MLF過程中乳酸菌對葡萄酒理化指標的影響，本研究分別以JN1、ZN3、GN9和S1作為發酵劑開啟赤霞珠葡萄酒MLF過程，以不添加發酵劑為空白對照，監測處理樣和空白樣中殘糖量、總酸、pH、酒精度等各項理化指標變化(表2)。

表2 理化指標變化Table 2 Changes of physicochemical indexes

2.3 乳酸菌對揮發性香氣物質組成的影響

MLF過程會引起葡萄酒中揮發性香氣物質的改變，不同菌株會產生不同的香氣[19]，表3展示了各組中鑒定出的主要揮發性香氣物質。4個發酵酒樣和空白對照組中共鑒定出67種主要揮發性香氣物質。包括25種醇類、2種酚類、6種醛類、3種酮類、7種酸類、15種酯類、5種芳香族類、其他類別4種。醇類是主要的揮發性成分，占總香氣物質的84.49%～93.29%，在酒精發酵結束后，酵母菌在葡萄酒中積累了大量醇類，構成了葡萄酒的主要香氣成分[20]。異戊醇是主要醇類物質，同時在總體香氣物質中含量最高，占總香氣物質含量的61.81%～76.78%。先前有研究表明，異戊醇是發酵過程中由亮氨酸進行脫羧反應和脫氨作用的產物，會給葡萄酒帶來草本植物的味道，是葡萄酒重要的風味化合物[21]。其余成分中，酚類占比0.48%～2.16%、醛類占比1.35%～4.19%、酮類占比0～1.67%、酸類占比2.62%～6.73%、酯類占比1.34%～2.98%、芳香族類占比0～1.91%、其他類占比0～0.14%。乙酸和辛酸是主要酸類，乙酸是由乳酸菌對檸檬酸的分解代謝形成的，提供了刺激氣味[22]，辛酸提供了汗液和奶酪氣味[19]。乙酸乙酯為主要酯類，由乙酰輔酶A與氨基酸或糖類降解后產生的高級醇反應生成，賦予了葡萄酒水果和指甲油氣味[23]。2，4-二叔丁基苯酚和2，4-二甲基苯甲醛是主要酚類和醛類。酮類、芳香族類和其他類的含量較低，對葡萄酒MLF過程前后香氣物質的貢獻作用較小，這也與先前的研究結果保持一致[24-25]。

表3 揮發性香氣物質和含量Table 3 Analysis of volatile aroma compounds and content

續表3

5個酒樣中所含香氣物質種類數目由大到小排序為：S1>JN1>ZN3>GN9=空白對照，5個酒樣中所含香氣物質總含量由大到小排序為：JN1>ZN3>S1>空白對照>GN9。JN1酒樣共檢測出49種香氣物質，與空白對照相比，含量增加的香氣物質有25種，其中新產生的香氣物質有6種(3-甲基-3-丁烯-1-醇、4-甲基-2-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-羥基-3-甲基-2-丁酮、3-羥基-2-丁酮和癸酸乙酯)。ZN3酒樣共檢測出46種香氣物質，與空白對照相比，含量增加的香氣物質有31種，其中新產生的香氣物質有8種(3-甲基-1-戊醇、3-羥基-2-丁酮、正癸酸、己酸乙酯、癸酸乙酯、水楊酸甲酯、乙酸異戊酯和甲基萘)。GN9酒樣共檢測出45種香氣物質，與空白對照相比，含量增加的香氣物質有20種，其中新產生的香氣物質有8種(3-甲基-1-戊醇、2-辛醇、3-羥基-2-丁酮、正癸酸、己酸乙酯、癸酸乙酯、水楊酸甲酯和甲基萘)。S1酒樣共檢測出51種香氣物質，與空白對照相比，含量增加的香氣物質有36種，其中新產生的香氣物質有15種(3-甲基-1,3,5-戊三醇、3-甲基-1-戊醇、葉醇、2-[2-[4-(3-甲氧基苯基)哌嗪-1-基]乙基]-2-苯基-1，3-二氫茚-1，3-二醇、癸醇、3，5-二-叔丁基-O-鄰苯二酚、(7Z)-6，10-二甲基十一烷-5，9-二烯-2-酮、壬酸、正癸酸、3-甲基戊酸乙酯、癸酸乙酯、水楊酸甲酯、長葉烯、正十六烷、7-乙基-1，3，5-環庚三烯)。

綜上所述，4株乳酸菌進行MLF過程后，對葡萄酒中香氣物質的種類及含量具有重要調節作用，形成各自獨特的香氣組成結構。除GN9外，其他菌株參與發酵后均使香氣物質的種類和含量有所增加。不同乳酸菌發酵后的香氣物質通過數量、種類以及相互之間的協調作用使葡萄酒展現出特有的香氣。

2.4 關鍵性香氣物質的主成分分析

僅通過分析香氣物質的種類和含量，無法確定各種香氣物質對葡萄酒香氣的貢獻大小，因此引入香氣活力值(odor activity value，OAV)來確定關鍵性香氣物質，從而進一步研究不同乳酸菌賦予葡萄酒的風味。OAV是由該物質的含量除以其閾值得到的，OAV>1的香氣物質對葡萄酒的風味貢獻較顯著，且OAV越大對香氣特征作用越明顯，而OAV<1的物質對葡萄酒的風味貢獻較小，只起到協香作用[26]。因此，我們將OAV>1的香氣物質歸為關鍵性香氣物質。計算OAV，結果如表4所示。

表4 揮發性香氣物質的OAV(OAV>1)Table 4 OAV of volatile aroma compounds

由表4可知，共有16種香氣物質的OAV>1，包括醇類、醛類、酸類和酯類。其中，OAV>10的物質有4種(異戊醇、辛酸乙酯、癸醛和壬醛)，OAV>100的物質有2種(癸醛和壬醛)，這些即為酒樣中的關鍵性香氣物質。各組中關鍵性香氣物質數目的排序為：ZN3(12種)>S1(11種)>JN1(10種)>空白對照(8種)>GN9(7種)，OAV總和的排序為：ZN3(629.16)>GN9(275.06)>S1(264.85)>JN1(192.52)>空白對照(186.6)。由排序可知，ZN3酒樣具有最高的香氣評價。但是，由于關鍵性香氣物質在不同樣本中的濃度差異較大，而且香氣功能相近的化合物之間存在協同作用，單純地分析數目和含量并不能夠直接反映酒樣的香氣特征。因此，為了進一步分析關鍵性香氣物質對不同酒樣的貢獻，明確各個酒樣的香氣成分差異。將16種關鍵性香氣物質的OAV和5個酒樣進行主成分分析，如圖2所示。

圖2 OAV>1的香氣物質對前2個主成分分析圖Fig.2 PCA of aroma compounds with OAV greaterthan 1 to the first two principal components注：JN1、ZN3、GN9和S1為各個酒樣編號，KB為空白對照組；數字1～16為各香氣物質的編號，見表4

PC1和PC2的解釋率分別為48.9%和23.7%，5個酒樣可清楚地分為3組，第1組是GN9酒樣和空白對照組，位于第Ⅱ象限，第2組是JN1酒樣，位于第Ⅲ象限，第3組是ZN3酒樣和S1酒樣，位于第Ⅳ象限。丁內酯(甜味、焦糖味)對GN9酒樣的風味貢獻較大，3-甲基丁酸(果香味)、(E)- 3-己烯-1-醇(花香味)、異戊醇(奶酪味)和正己醇(果香味、青草味)對JN1酒樣的風味貢獻較大，癸醛(脂肪味)、乙醛(果香味、咖啡香味)、正辛醇(柑橘味、玫瑰味)和3-甲基丁酸乙酯(果香味、茴香味)對ZN3酒樣的風味貢獻較大，乙酸-2-苯乙酯(玫瑰味和蘋果味)、壬醛(玫瑰味和柑橘味)、辛酸乙酯(白蘭地香味)、辛酸(奶酪味)和2-苯乙醇(花香味、玫瑰味)對S1酒樣的風味貢獻較大。上述結果與各香氣物質在不同酒樣中的OAV有一定對應關系，即對某酒樣貢獻作用較大的香氣物質，在該酒樣中同樣也具有較高的OAV。

2.5 感官評價

如圖3所示，其中ZN3酒樣的柑橘類(葡萄味等)、莓果類(草莓味等)、果園水果(蘋果味等)、乳酸(奶酪味等)、香料(茴香味等)、果醬(果糖味等)感官分數均為最高值，與ZN3酒樣的關鍵性香氣物質結果分析中乙醛(果香味和咖啡香味)、己酸乙酯(果香味和茴香味)、辛酸乙酯(白蘭地香味)、癸醛(脂肪味)、壬醛(玫瑰味、柑橘味)、乙酸異戊酯(香蕉味)和丁內酯(甜味和焦糖味)的高含量相對應，同時與ESCUDERO等[30]研究發現酯類化合物可增強發酵葡萄酒中的水果香氣和花香的結論相符。JN1酒樣的果樹類感官分數為最高值。S1酒樣的花香(玫瑰味等)感官分數為最高值，與S1酒樣的關鍵性香氣物質結果分析中正辛醇(柑橘類和玫瑰味)、乙酸-2-苯乙酯(玫瑰味和蘋果味)和2-苯乙醇(花香味和玫瑰味)的高含量相對應。綜上所述，乳酸菌參與MLF過程后，香氣評價優于未發生MLF過程的空白對照組，整體香氣可接受性總得分由大到小依次為：ZN3酒樣>JN1酒樣>GN9酒樣=S1酒樣>空白對照。

圖3 香氣評價圖Fig.3 Radar map of aroma evaluation

3 結論與討論

本研究分別以酒酒球菌JN1、植物乳桿菌ZN3、干酪乳桿菌GN9和商業菌株S1為發酵劑對赤霞珠葡萄酒進行MLF過程，并以未進行MLF過程的酒樣作為空白對照。4株菌均具有MLF能力，MLF能力由大到小排序為：ZN3>S1>JN1>GN9。4株菌參與MLF后，酒樣的總酸和殘糖含量降低，pH升高，酒精度和SO2含量未發生明顯變化。酒樣中共檢測到了67種香氣物質，包括25種醇類、2種酚類、6種醛類、3種酮類、7種酸類、15種酯類、5種芳香族類、其他類別4種，其中，異戊醇是葡萄酒中主要香氣物質。除GN9外，其他菌株經MLF過程后均使香氣物質的種類和含量有所增加。5個酒樣中的關鍵性香氣物質(OAV>1的香氣物質)共有16種(乙醛、異戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸醛、正辛醇、3-甲基丁酸、3-甲基丁酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、辛酸、壬醛、正己醇、(E)- 3-己烯-1-醇、乙酸異戊酯、丁內酯和2-苯乙醇)，其中ZN3酒樣具有最高的香氣評價。丁內酯(甜味、焦糖味)為GN9酒樣的特征性香氣物質，3-甲基丁酸(果香味)、(E)- 3-己烯-1-醇(花香味)、異戊醇(奶酪味)和正己醇(果香味、青草味)為JN1酒樣的特征性香氣物質，癸醛(脂肪味)、乙醛(果香味、咖啡香味)、正辛醇(柑橘味、玫瑰味)和3-甲基丁酸乙酯(果香味、茴香味)為ZN3酒樣的特征性香氣物質，乙酸-2-苯乙酯(玫瑰味和蘋果味)、壬醛(玫瑰味和柑橘味)、辛酸乙酯(白蘭地香味)、辛酸(奶酪味)和2-苯乙醇(花香味、玫瑰味)為S1酒樣的特征性香氣物質。

結果表明，分離篩選出的乳酸菌具有良好的MLF能力，相比于商業菌株S1，它們參與發酵后的酒樣具有風格迥異的風味結構。植物乳桿菌ZN3具有最強的MLF能力，能顯著增加香氣物質的種類和含量，在關鍵性香氣分析和感官分析中均具有最優評價。對比商業菌株S1，發現其具有一定商業運用潛力，在后續工作中可進一步開展商業菌株開發應用相關實驗，如混菌發酵的發酵特性，相關組學分析揭示特性機理等。本研究為確定葡萄酒中乳酸菌參與MLF過程產生的香氣物質成分以及含量提供了可靠的參考數據，為乳酸菌在葡萄酒MLF過程中的應用及其品質控制奠定理論基礎，為葡萄酒生產技術和質量評價提供了重要的實用價值。