甘肅河西走廊產區本土酒酒球菌對赤霞珠干紅葡萄酒香氣品質的影響

王詩，王璐璐，趙丹丹，楊學山，韓舜愈，祝霞*

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州， 730070) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅 蘭州， 730070)

微生物菌群在葡萄酒發酵過程中產生的次級代謝產物和生物酶，會直接影響酒體中揮發性香氣化合物的種類、含量和演變過程，決定著葡萄酒的風格和典型性[1]。由酒酒球菌(Oenococcusoeni)誘發的蘋果酸-乳酸發酵(malolactic fermentation，MLF)是釀造高品質干紅葡萄酒和部分高酸度白葡萄酒的必需工藝，可將酒體中粗糙、尖劣的L-蘋果酸轉化為柔和、圓潤的L-乳酸，對改善口感、提升和修飾揮發性香氣成分具有積極作用[2-3]。同時，適應了產區風土的優良本土O.oeni能夠與葡萄原料特性更加契合，在MLF過程中可以更加有效地呈現產區微生物風土特色[4-7]。葡萄酒產業發達的國家如法國、意大利、加拿大、葡萄牙等均對本產區O.oeni進行了分離、篩選和發酵性能分析研究，獲得了釀酒適應性和發酵特性優良的菌株，并在生產中商業化推廣應用，有效提升了葡萄酒的品質和地域風格[8-11]。張春暉[12]、盧新軍[13]、薛雪[14]、喬慧等[15]分別對從山東煙臺、河北昌黎、寧夏銀川、內蒙古等葡萄酒產區篩選、鑒定的本土O.oeni進行釀造適應性研究，結果均表明，發酵特性優良的本土O.oeni菌株應用于葡萄酒MLF后，酒樣中香氣化合物，尤其是酯類、高級醇等發酵香氣物質表現更為豐富、多樣，具備釀造差異化明顯、典型性突出的優質葡萄酒應用潛力。

甘肅河西走廊地處北緯36～40°，干旱少雨，晝夜溫差大，釀酒葡萄種植區以沙質土壤為主，礦物質豐富，具備生產優質葡萄酒的良好生態條件[16]。然而企業在實際生產中大多采用進口發酵劑進行MLF，導致產品同質化問題非常嚴重，無法適應多元化、個性化的消費市場需求。本實驗以甘肅河西走廊葡萄酒產區分離鑒定的4株O.oeni為供試菌株，通過微釀實驗分析比較本土菌株與商業菌株OMEGA對赤霞珠(Cabernet Sauvignon)干紅葡萄酒香氣品質的影響及差異，以期為本土O.oeni菌株的工業化生產應用及釀造代表河西走廊產區風味的葡萄酒提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤霞珠葡萄采自甘肅莫高實業發展有限公司武威黃羊河種植基地，可滴定酸(以酒石酸計)5.87 g/L，含糖量約為22.3 Brix°(223 g/L)。

本土O.oeniMG-1、MG-7、QL-11、ZX-1菌株，均由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室從河西走廊葡萄酒產區分離、鑒定并保存。商業O.oeniOMEGA，購自法國Lallemand公司；釀酒酵母ES488，購自意大利Enartis公司。

L-蘋果酸檢測試劑盒,愛爾蘭Megazyme公司；香葉醇、β-香茅醇、(Z)-橙花叔醇、α-萜品醇、里那醇、β-大馬士酮、2-辛醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸甲酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙醇、戊醇、己醇、金合歡醇、辛酸等香氣標準品(色譜純),美國Sigma公司；蛋白胨、酵母浸粉、MgSO4、MnSO4、NaOH、無水葡萄糖、HCl、酒石酸、無水乙醇、偏重亞硫酸鈉等常規試劑均為國產分析純，天津光復化工研究所。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；BCD642WDVMU1立式冰箱，青島海爾股份有限公司；pHS-3C精密pH計，上海雷磁場儀器廠；TRACE 1310-ISQ氣相色譜-質譜聯用儀、ISQ單四級桿質譜儀，美國Thermo Scientific公司；DB-WAX氣相色譜柱，美國Agilent Technologies公司；50/30 μmDVB/CAR-PDMS固相微萃取裝置、萃取頭，上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 ATB培養基的配制

ATB基礎培養基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母浸粉5，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·4H2O 0.05，鹽酸半胱氨酸0.5，番茄汁25%(體積分數)，液體培養基使用1 mol/L NaOH調pH至4.8，固體培養基調pH至5.0，并向其中加質量濃度20 g/L的瓊脂，121 ℃滅菌20 min。其中葡萄糖于115 ℃滅菌15 min，在超凈工作臺內按質量濃度比例混合。

1.3.2 菌株活化

配制ATB液體培養基，121 ℃濕熱滅菌20 min后，置于無菌超凈工作臺中冷卻。取冷凍保存的O.oeni菌株，室溫下放置2 h后，從斜面培養基上挑取2環接種至配制好的液體培養基中，于28 ℃培養箱中培養，備用。

1.3.3 葡萄酒微釀實驗

選用赤霞珠葡萄，參照小容器釀造工藝法[17]完成乙醇發酵后，將乙醇體積分數為12.3%、殘糖質量濃度為2.1 g/L、L-蘋果酸質量濃度為3.378 g/L的酒樣分裝入15個2.5 L棕色玻璃瓶，分為5組(n=3)。其中4組分別以體積分數為4%的接種量(1×107CFU/mL)量取活化后的本土O.oeni菌液，3 000 r/min離心10 min后棄去上清液，然后將沉淀用酒樣洗入發酵瓶中；對照商業菌株OMEGA按照推薦用量0.02 g/L(質量濃度)接種。置于20 ℃啟動MLF，當酒樣中L-蘋果酸質量濃度≤0.3 g/L時，結束發酵。

1.3.4L-蘋果酸含量測定

參照L-蘋果酸檢測試劑盒推薦的方法，測定發酵酒樣中L-蘋果酸含量，分析O.oeni菌株的L-蘋果酸降解能力。

1.3.5 理化指標測定

參照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[18]中的實驗方法進行。殘糖：斐林試劑滴定法；酒精：酒精計法；pH：精密pH計測定；總酸：酸堿滴定指示劑法，結果以酒石酸(g/L)計；揮發酸：水蒸氣蒸餾法，結果以乙酸(g/L)計；總SO2：碘量法。

1.3.6 揮發性香氣成分分析

參照祝霞等[19]的香氣物質萃取方法及GC-MS條件，略作修改。各發酵酒樣重復測定3次。

1.3.6.1 香氣成分富集

取8 mL待測酒樣加入15 mL頂空瓶中，同時加入2.5 g NaCl、10 μL 2-辛醇(質量濃度88.2 mg/L)，加磁力攪拌轉子后用封口膜封口并搖勻，放入恒溫加熱磁力攪拌器中，40 ℃水浴平衡30 min，然后插入萃取針(旋出萃取頭)頂空萃取30 min。

1.3.6.2 GC-MS條件

GC條件：色譜柱DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)，進樣口溫度240 ℃，傳輸線溫度230 ℃，離子源溫度250 ℃，不分流進樣；載氣(He)流速1 mL/min；進樣時間5 min；柱溫升溫程序：40 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，保持15 min。

MS條件：電子轟擊離子源(EI)；電子能量70 eV；傳輸線溫度180 ℃；離子源溫度200 ℃；質譜掃描范圍m/z50～350。

1.3.6.3 定性與定量分析

目標化合物采用保留指數(retention index，RI)、NIST-11、Wiley和香精香料譜庫檢索比對，結合譜圖分析進行定性。利用標準曲線(R2>0.995)對已有標準品的高級醇、酯類、萜烯類化合物，進行定量，無標準品的化合物采用化學結構、官能團相似、碳原子數相近的標準物質進行半定量。

1.3.7 感官評價

參照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》及祝霞等[20]的方法，略作修改。各酒樣隨機編號后，由9名經過葡萄酒品鑒培訓的人員(5女，4男)進行3輪盲品，分別從外觀、香氣和口感方面，以具體評價角度對各酒樣進行品評。使用10分結構化數值尺度來量化，0～10分表示感覺強烈程度逐漸增大。

表1 葡萄酒感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of wine

1.4 數據處理與分析

對供試樣本(n=3)所得數據采用Microsoft Office Excel 2013、Origin 2018進行基本處理和作圖，采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件進行Duncan’s多重比較以及差異顯著性分析，并對香氣化合物進行主成分分析(principal component analysis，PCA)。

2 結果與分析

2.1 干紅葡萄酒微釀實驗

2.1.1 葡萄酒MLF期間L-蘋果酸含量變化

圖1所示為酒精發酵結束后，分別接種4株O.oeni進行MLF時，L-蘋果酸含量的變化趨勢。除對照組酒樣(未接菌，CK)外，其余葡萄酒中L-蘋果酸含量均呈下降趨勢。不同菌株對L-蘋果酸的分解速率存在一定差異。剛接入菌株1 d時，所有菌株均能分解葡萄酒中的L-蘋果酸。其中ZX-1發酵的葡萄酒中L-蘋果酸含量下降最快，24 h時L-蘋果酸含量約從3.400 g/L迅速降至2.600 g/L，相比其他菌株降酸速率最快。在隨后的第2～6天，MG-1酒樣分解速率緩慢，在此期間L-蘋果酸含量共降低了約0.400 g/L，降酸速率最低；但在6 d之后，MG-1酒樣中L-蘋果酸含量開始以約0.600 g/L的速率下降，快速消耗葡萄酒中L-蘋果酸。當L-蘋果酸含量降至0.300 g/L時，所有菌株降酸速率均變得緩慢。在MLF 9 d后，ZX-1最先完成發酵，處理的酒樣中L-蘋果酸含量僅剩0.008 g/L，其次是MG-1(11 d)，而QL-11和MG-7完成MLF分別用時13和14 d；而OMEGA菌株在第13天時，L-蘋果酸含量為0.283 g/L，未接菌的對照組CK酒樣蘋果酸含量幾乎無變化。結果表明，所有菌株均具有良好的降解L-蘋果酸的能力。

圖1 葡萄酒MLF期間L-蘋果酸含量變化Fig.1 Changes of L-malic acid content in wine during MLF

2.1.2 MLF后葡萄酒基本理化指標

對MLF前后的葡萄酒樣進行基本理化指標的測定，結果見表2。

表2 蘋果酸-乳酸發酵前后葡萄酒樣理化指標Table 2 The physical and chemical indexes of wine sample before and after MLF

由表2可知，供試菌株均能夠分解葡萄酒中的L-蘋果酸，降低葡萄酒的總酸含量，使pH升高，并順利完成MLF，而在未加菌的對照組酒樣中，L-蘋果酸含量變化不大。其中O.oeniZX-1和MG-1幾乎能夠完全發酵葡萄酒中的L-蘋果酸，使總酸含量更低。總體而言，MLF后的赤霞珠干紅葡萄酒基本理化指標均符合國標GB 15037—2006《葡萄酒》的要求。

2.2 葡萄酒樣香氣成分分析

2.2.1 不同菌株MLF后酒樣香氣成分GC-MS分析

采用HS-SPME/GC-MS對未接菌酒樣及商品菌OMEGA和4株本土酒酒球菌MLF后酒樣產生的揮發性香氣物質進行分析，結果見圖2。

由圖2可知，實驗共檢出90種香氣物質，其中醇類22種、酯類38種、酸類11種、萜烯類13種和其他類6種。其中，QL-11和MG-7菌株發酵的酒樣中均檢出78種香氣成分，是檢出香氣物質種類最多的2株菌，且菌株QL-11是所有菌株中香氣物質總含量(15.16 mg/L)最高的菌株；MG-1和ZX-1分別檢出香氣物質67種(總含量13.76 mg/L)和71種(總含量14.33 mg/L)；OMEGA酒樣中共檢出62種香氣物質(總含量13.43 mg/L)；而CK葡萄酒樣中共檢測到58種香氣成分(總含量12.60 mg/L)。

不同菌株發酵的酒樣產生同類香氣物質的種類和含量存在差異。實驗共檢出酯類化合物38種，是5種處理酒樣中檢出種類最多、含量最高的香氣物質。其中QL-11是檢出酯類最多的菌株，共35種(總含量6.92 mg/L)；其次為MG-7，共檢出33種(總含量5.11 mg/L)，而CK酒樣中檢出酯類化合物最少，為25種(總含量6.24 mg/L)。在6種處理下，辛酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸異戊酯等具有的菠蘿、香蕉以及花香味成分均有檢出[21]；而己酸甲酯、十四酸乙酯、水楊酸甲酯等具有的菠蘿、奶油味、冬青味和葡萄味化合物[22]在接種了本土O.oeni的酒樣中均有檢出，而在未接菌的CK酒樣和接種了商品菌OMEGA酒樣中均未檢出；在QL-11酒樣中檢出具有花香、蘋果等果香味的化合物乙酸辛酯，而在其他酒樣中均未檢出。

a-酯類物質；b-高級醇類物質；c-酸類物質；d-萜烯類物質；e-其他類物質圖2 葡萄酒揮發性香氣成分的GC-MS分析Fig.2 Volatile aroma components of wines by GC-MS analysis注：不同小寫字母表示樣品間具有顯著性差異(P<0.05)

QL-11是產高級醇種類和含量最多的菌株，分別為19種和6.65 mg/L。在進行了MLF的酒樣中主要檢出3-甲基-1-戊醇、月桂醇、2,3-丁二醇、4-甲基-1-戊醇等具有溶劑味、花香果香、黃油味、烘烤味的香氣成分[23]，而CK酒樣中未檢出。

有機酸類物質種類較多的酒樣為MG-7(總含量1.09 mg/L)和CK(總含量1.08 mg/L)，均檢出10種物質；酸類化合物種類和含量檢出均最少的為MG-1酒樣，共6種(總含量0.94 mg/L)，其中檢出含量最高的酸為帶有奶油味的辛酸[24]，在OMEGA酒樣中含量最高，為0.89 mg/L。

萜烯類和其他類化合物是所有酒樣中檢出總體含量較少的香氣物質。其中菌株ZX-1發酵的酒樣檢出萜烯類化合物的種類和含量均為最高，共12種(總含量0.20 mg/L)，而其他類化合物共檢出5種(總含量0.12 mg/L)。同時，其他類物質以MG-7檢出種類最多(6種)，但含量(0.02 mg/L)最低。所有接種本土O.oeni發酵的酒樣中檢出萜烯化合物種類和含量均高于CK和OMEGA酒樣。主要檢出萜烯類化合物為β-紫羅蘭酮、金合歡醇和萜品醇等具有花香、果香、植物香的物質[25]。檢出其他類化合物有β-環檸檬醛、香茅醛及2,4-二叔丁基苯酚等香氣物質[26]。綜合分析可知，使用本土O.oeni進行MLF的酒樣酯類、醇類和萜烯類化合物含量均有增加，OMEGA發酵的酒樣中黃油味、乳酪味和烘烤香氣物質更為突出。其中乳酸異戊酯、2,3-丁二醇、2-壬醇、2-甲基丁酸、β-紫羅蘭酮、金合歡醇及β-環檸檬醛等物質能夠豐富葡萄酒的花香、果香味，但在CK組中未檢測到。從香氣物質種類和總含量來看，QL-11和ZX-1能夠產生更多的香氣物質。

2.2.2 不同菌株MLF后酒樣香氣化合物主成分分析

不同O.oeni菌株對酒體揮發性香氣成分的影響較為復雜，且不同菌株發酵的酒樣間香氣化合物種類及含量存在差異[27]。為進一步探究不同O.oeni進行MLF后酒樣在香氣成分上的整體差異，采用PCA多元統計法研究揮發性香氣化合物的變化[28]。以特征值>1提取主成分，得到PC1、PC2和PC3的方差貢獻率分別為46.385%、19.882%和16.985%，3個主成分累計方差貢獻率為83.252%，基本能夠反映原數據83.252%的變異信息。各香氣物質在PC1、PC2和PC3上的因子載荷如圖3所示，香氣化合物酒樣分布見圖4。

由圖3可知，PC1主要反映了A22(壬酸乙酯)、A24(癸酸甲酯)、B10(辛醇)、B14(2,4-丁二醇)、C3(2-甲基丁酸)、C8(辛酸)、D7(橙花醇)、D8(香葉醇)等酯類物質及具有水果、奶油、乳香味的醇類、酸類以及具有花果香的萜烯類香氣化合物的變異信息；化合物C10(乙酸)、D1(β-大馬士酮)等與PC1高度負相關。PC2主要體現了B16(苯甲醇)、B22(2-壬醇)、C4(癸酸)、D6(金合歡醇)、D10(α-松油醇)等具有水果香、奶酪等香氣物質信息，而PC2負半軸香氣物質主要為A11(丙酸異戊酯)、A33(癸酸異戊酯)、A13(丁酸異戊酯)、A6(3-甲基丁酸乙酯)等酯類物質。PC3正半軸上得分較高的主要為B18(4-甲基-1-戊醇)、A14(辛酸異丁酯)、A7(戊酸乙酯)、B2(丁醇)、B13(3-甲基-1-戊醇)等香氣化合物，這些化合物能夠賦予葡萄酒豐富的花果香味；而其負半軸區域有突出表現的香氣成分主要為A17(反式-2-己烯酸乙酯)、A23(辛酸正丁酯)、B11(反式-2-辛烯-1-醇)、B19(反式-3-己烯-1-醇)、C5(己酸)、D2(香葉基丙酮)等具有青草味和乳味的香氣物質。

a-PC1-PC2; b-PC1-PC3圖3 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖Fig.3 Factor loadings plot of PCA for volatile aromacompounds

由圖4可知，CK和MG-7酒樣可聚為一類，在PC2負半軸及PC3負半軸上得分較高，表明丙酸異戊酯、癸酸異戊酯、3-甲基丁酸乙酯、反式-2-辛烯-1-醇、香葉基丙酮等具有紫丁香、青草味的香氣物質含量較高。位于香氣物質更加聚集區域的QL-11和MG-1，其PC1正半軸和PC3正半軸上得分均較高，主要代表了具有濃郁花香、果香和乳香味的酯類和高級醇類物質的香氣特征信息。ZX-1酒樣代表了PC1正半軸和PC2正半軸以及PC3負半軸上的特征香氣物質信息，這一區域香氣物質豐富多樣，主要為乙酸乙酯、庚酸乙酯、苯甲醇、2-甲基丁酸、橙花醇、香葉醇等高級酯、高級醇及萜烯類香氣成分，這些物質可使葡萄酒具有更濃郁的花香、果香和乳香等MLF特征香氣物質，增加葡萄酒香氣復雜性。而OMEGA酒樣主要分布于PC1負半軸和PC3正半軸，代表了異丁酸、9-癸烯酸等具有黃油、脂肪味的有機酸類以及2-乙基己醇、異丁醇、丁二酸二乙酯、乙酸辛酯等具有花香、蘋果等甜果香味的酯和醇類。

圖4 香氣化合物主成分分析的酒樣分布圖Fig.4 Score plot of wine samples for PCA of the volatilearoma compounds

2.3 感官結果分析

圖5為不同菌株MLF赤霞珠干紅葡萄酒感官分析雷達圖。

圖5 赤霞珠干紅葡萄酒感官分析雷達圖Fig.5 Radar map of sensory analysis for CabernetSauvignon dry red wine

由圖5可知，在色澤方面CK與OMEGA、MG-7、MG-1、QL-11和ZX-1菌株發酵酒樣并無明顯差異；從口感方面分析，MLF可使酒樣的口感變得更加柔和圓潤。QL-11菌株發酵酒樣的花香、果香味較為突出，而MG-7、MG-1、ZX-1菌株的花香、果香、余味長短無明顯差異，但均高于CK與OMEGA菌株。整體而言，MLF后酒樣在香氣、余味長短、典型性方面均高于CK，這是因為MLF提高了酒樣中的酯類、酸類、醇類化合物含量，與MATURANO等[29]的研究結果一致。綜合分析，采用本土O.oeni進行MLF后酒樣更有利于花果香的形成，使酒體典型性更突出。

3 結論

赤霞珠干紅葡萄酒MLF微釀實驗結果表明，4株本土O.oeni均能順利完成MLF，但發酵時間存在差異，其中ZX-1菌株9 d完成了發酵，降酸能力最強，其次是MG-1(11 d)，而QL-11、MG-7和OMEGA菌株均在14 d左右完成了MLF，且發酵酒樣理化指標均符合國標(GB/T 15037—2006《葡萄酒》)要求；香氣化合物GC-MS分析檢測結果表明，與未進行MLF的(CK)酒樣相比，接種本土O.oeni進行MLF的酒樣揮發性香氣物質更加豐富、多樣，其中QL-11菌株發酵酒樣中酯類、醇類、萜烯類等化合物含量明顯增多，表現為更濃郁的花香、果香味；而商品菌株OMEGA發酵酒樣中黃油、脂肪味化合物含量較高，與感官評價分析結果相一致。總體而言，QL-11菌株具有釀造代表甘肅河西走廊產區特色葡萄酒的應用潛力。