不同特征患者胚胎植入前遺傳學檢測結果和治療結局分析

楊小璇，王菁，沈鑒東，謝佳孜，崔毓桂，劉嘉茵，吳畏

(南京醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心，南京 210000)

在備孕夫婦中，有20%面臨不孕困擾，其中約三分之一的病例由男性因素引起[8-9]。男性精子DNA碎片指數(DNA fragmentation index，DFI)作為傳統精液分析的補充，具有較強的穩定性，是預測男性生育力有價值的指標[10-11]。研究發現DFI可能對胚胎非整倍體的發生具有潛在影響[12]。

本研究對行PGT助孕患者進行多種組間分類，分析不同類型患者染色體異常率及胚胎異常率的差異及妊娠結局，為深入理解胚胎染色體異常的發生提供思路，為PGT技術應用人群的選擇提供臨床依據。

材料與方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2011年6月至2019年12月于本中心行PGT助孕的1 602個取卵周期及對應的復蘇周期。其中有1 066個周期進行了DFI檢測。

1.根據夫婦雙方是否有染色體核型異常分組：(1)夫婦雙方染色體核型均正常的分為：有復發性流產病史(PGT-A)組和無復發性流產史但有遺傳病生育風險(PGT-M)組。(2)夫婦雙方至少一方染色體核型異常的，根據染色體核型分為普通易位組和羅氏易位組。再根據染色體易位發生的性別差異分組：普通易位組中，易位發生在女方為A組、易位發生在男方為B組；羅氏易位組中，易位發生在女方為C組、易位發生在男方為D組。

2.根據精子DFI檢測結果，以20%為臨界值分為低DFI組和高DFI組。

二、研究方法

1.促排卵方案：所有患者均采用合適的促排卵方案。當主導卵泡的直徑達到18 mm左右，注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)，36 h后陰道超聲引導下行取卵術。使用精子染色質結構分析(sperm chromatin structure assay，SCSA)作為DFI檢測方法。

2.胚胎檢測：使用微陣列-比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridiza-tion，aCGH)或二代測序技術(next-generation sequencing，NGS)進行囊胚活檢或卵裂球活檢。胚胎異常率=非整倍體胚胎數目/活檢胚胎數目；染色體異常率=非整倍體胚胎的異常染色體總條數和/(活檢胚胎數目×46)。MⅡ受精率=受精卵數/MⅡ卵子數；卵裂率=發生卵裂的受精卵數/總受精卵數；D3胚胎形成率=形成D3胚胎數/發生卵裂的受精卵數；囊胚形成率=形成囊胚數/D3胚胎數。

3.妊娠結局隨訪：移植后2周隨訪血清β-HCG，β-HCG>25 U/L時為HCG陽性，停經50 d左右行陰道超聲檢查，記錄宮腔孕囊數目和心管搏動確定臨床妊娠；停經70 d第二次陰道超聲檢查了解胚胎發育情況；后期電話隨訪流產或活產情況。HCG陽性率=HCG陽性周期數/取卵周期數；累積妊娠率=臨床妊娠周期數/取卵周期數；流產率=流產周期數/臨床妊娠周期數；累積活產率=活產數/臨床妊娠周期數。

養殖場衛生環境較差，通風不良，糞便不能及時清理，濕度較大，導致蟲卵生長發育，也有利于螨蟲的寄生活動。因此，要高度重視養殖舍衛生環境控制，強化養殖舍通風換氣，減少成蟲寄生場所，控制養殖舍內害蟲密度，一旦鵝群出現不安現象，應該及時查明原因，及時采用藥物消滅成蟲，將病情控制在萌芽階段，將損失降低到最小程度。

三、統計學分析

結 果

一、PGT-A組和PGT-M組一般資料、實驗室指標和妊娠結局比較

PGT-A組納入308個周期，檢測1 174枚胚胎；PGT-M組納入108個周期，檢測338枚胚胎。兩組在女方年齡、男方年齡、女方體重指數(BMI)、血清基礎FSH、基礎LH和抗苗勒管激素(AMH)水平方面，差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

與PGT-M組相比較，PGT-A組的D3胚胎形成率、囊胚形成率顯著降低(P<0.05)；染色體異常率、胚胎異常率顯著升高(P<0.01)。單次取卵周期中，PGT-A組的累積妊娠率顯著降低，流產率顯著升高(P<0.05)。兩組累積活產率差異無統計學意義(P>0.05)(表2)。PGT-A組和PGT-M組分別有26例和12例仍在繼續妊娠中。

表1 PGT-A組與PGT-M組基礎情況比較(-±s)

表2 PGT-A組與PGT-M組實驗室指標及妊娠結局比較(%)

二、普通易位組和羅氏易位組的一般資料、實驗室指標和妊娠結局比較

1.總體比較：普通易位組納入829個周期，檢測胚胎3 600枚；羅氏易位組納入357個周期，共檢測胚胎1 595枚。兩組在女方年齡、男方年齡、女方體重指數(BMI)、血清基礎FSH、基礎LH和AMH水平方面，差異均無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 普通易位組與羅氏易位組基礎情況比較(-±s)

兩組卵裂率、D3胚胎形成率差異無統計學意義(P>0.05)。與羅氏易位組相比較，普通易位組的囊胚形成率顯著降低，染色體異常率和胚胎異常率顯著升高(P<0.01)，HCG陽性率和累積妊娠率均顯著降低(P均<0.05)。單次取卵周期，兩組妊娠結局的差異無統計學意義(P>0.05)(表4)。普通易位組和羅氏易位組分別有53例和22例仍在繼續妊娠中。

表4 普通易位組與羅氏易位組實驗室指標及妊娠結局比較(%)

2.易位發生性別亞組比較：A組納入387個周期、檢測胚胎1 698枚，B組納入442個周期、檢測胚胎1 902枚，C組納入145個周期、檢測胚胎669枚，D組納入212個周期、檢測胚胎926枚。A組與B組進行比較、C組與D組進行比較。在女方年齡、男方年齡、女方體重指數(BMI)、血清基礎FSH、基礎LH和AMH水平方面，組間差異均無統計學意義(P>0.05)(表5)。與B組相比較，A組的卵裂率顯著降低(P<0.05)；與D組相比較，C組的D3胚胎形成率顯著降低(P<0.05)。其他實驗室指標的組間差異均無統計學意義(P>0.05)(表6)。

表5 易位發生性別亞組基礎情況比較(-±s)

表6 易位發生性別亞組實驗室指標比較(%)

三、低DFI組和高DFI組一般資料、實驗室指標和妊娠結局比較

低DFI組納入890個周期、檢測3 669枚囊胚，高DFI組納入176個周期、檢測651枚囊胚。兩組在女方BMI、血清基礎FSH和基礎LH方面，差異無統計學意義(P>0.05)。低DFI組的雙方年齡均低于高DFI組，差異有統計學意義(P<0.01)(表7)。與高DFI組相比，低DFI組受精率顯著升高(P<0.05)，染色體異常率和胚胎異常率顯著降低(P<0.05，P<0.01)，兩組囊胚形成率、累積妊娠率、累積活產率差異無統計學意義(P>0.05)(表8)。

表7 低DFI組與高DFI組基礎情況比較(-±s)

表8 低DFI組與高DFI組實驗室指標及妊娠結局比較(%)

四、DFI和異常率的偏相關性分析

線性相關分析表明，DFI與染色體異常率、胚胎異常率之間有正相關關系(r=0.109，P<0.01；r=0.063，P<0.05)。男方年齡與DFI之間有正相關關系(r=0.133，P<0.01)。采用偏相關分析，控制雙方年齡變量，分析DFI與染色體異常率呈正相關(r=0.105，P<0.01)，與胚胎異常率不相關(r=0.057，P>0.05)(表9)。

表9 精子DFI與異常率的偏相關分析

討 論

生殖細胞染色體發生的隨機錯誤導致散發的自然流產標本中有50%～70%表現出某種細胞遺傳異常，最常見的核型是常染色體三體(60%)，X染色體單體(20%)和多倍體(20%)。無論夫婦雙方是否有反復妊娠丟失(RPL)病史，妊娠時均會受到這種錯誤的影響[13]。本研究中選擇夫婦雙方染色體核型正常進行單基因疾病診斷的PGT-M做對照組，其胚胎染色體仍有一定的異常率，證明了這一點。雙方年齡是配子及胚胎形成過程中非整倍體發生的重要影響因素。PGT-A組和PGT-M組的年齡等基礎情況差異無統計學意義，PGT-A組的D3胚胎形成率和囊胚形成率低于PGT-M組，而染色體異常率和胚胎異常率顯著升高，可見有復發性流產(RSA)病史的夫婦更難獲得胚胎，且胚胎更容易發生染色體異常，證實了對反復妊娠丟失人群進行非整倍體篩查的必要性。本研究中，PGT-A組和PGT-M組的夫婦均選擇整倍體胚胎移植，雖然累積活產率的差異無統計學意義，但PGT-A組累積妊娠率仍較PGT-M組低，而流產率高，說明除染色體異常因素外，RSA病史夫婦還受到其它流產危險因素的影響，PGT-A對其妊娠結局的改善效果有限，這與之前的報道一致[14-17]。

普通相互易位攜帶者較羅氏易位攜帶者更難獲得胚胎，且胚胎染色體異常率更高，累積妊娠率更低。而兩組流產率、累積活產率的差異無統計學意義，說明PGT-SR能夠通過移植正常/平衡胚胎改善染色體異常因素導致的不良妊娠結局[18]。普通易位組和羅氏易位組分別表現出易位發生在女方時卵裂率和D3胚胎形成率更低，而其他實驗室指標和胚胎異常率差異無統計學意義，說明卵母細胞染色體異?？赡苡绊懯芫研纬珊蟮脑缙谂咛グl育，而獲得正常胚胎的概率與易位發生在男方或女方無關[19]。

很大一部分精液正常的男性也表現出精子非整倍體增加，提示僅依靠常規精液參數無法鑒別出大部分處于精子非整倍體風險中的不育男性[12]。使用SCSA檢測精子DFI，其與精子總數、濃度、活力及前向運動百分率呈負相關關系[20-21]，在評估男性生育潛力方面更有臨床價值[9]。男方高齡對生殖結局有負面影響，包括延長受孕時間、增加胚胎移植失敗率、影響活產結局等[22-23]，甚至與孩子的自閉癥、精神分裂癥及某些類型染色體病的發生相關[24-25]。并非總能觀察到所有的常規精液參數隨年齡增加同時出現負性變化[26-27]，而精子DNA碎片的增加對年齡具有依賴性[9，26，28-29]。本研究在選擇PGT助孕患者中也發現了DFI與男性年齡呈正相關，控制雙方年齡變量，分析DFI與染色體異常率仍呈正相關，而與胚胎異常率不相關。低DFI組與高DFI組的累積妊娠率及妊娠結局差異無統計學意義。這說明精子DNA碎片的增加使異常胚胎的染色體組成更加混亂，但未顯著增加異常胚胎的數量，未達到影響更多胚胎的程度，可能與PGT均采取卵胞漿內單精子注射(ICSI)的受精方式有關，這與一些關于精子DFI和IVF妊娠結局沒有相關性的研究結果相一致[30-32]。此外，高DFI組患者的納入人數較少也可能影響妊娠結局的分析，需要更大樣本量的研究。

本研究通過分析不同特征人群的PGT治療周期，探索復發性流產史、染色體易位、精子DFI等影響胚胎染色體組成并可能預測臨床治療結局的因素，評估PGT對不同人群妊娠結局的益處，為理解胚胎染色體異常的發生提供思路，為高危人群相關臨床指標的篩查及PGT的合理選擇提供依據。