供精人工授精助孕患者人乳頭瘤病毒感染情況及妊娠結局分析

王莉莉，郝偉明，史雅萍，郅洋，李艷梅，梁云霞，張曉花，宋海霞，姬英英，郭興萍

(山西省生殖科學研究所生殖醫學中心，太原 030006)

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)屬乳多空病毒科，目前已鑒定出多種亞型。臨床上根據HPV的侵染偏好及致癌性，將其分為高危型、疑似高危型及低危型[1]。其中高危型感染除與生殖道疣、鱗狀上皮內病變(SIL)有關，更與女性宮頸癌的發生發展存在密切關聯[1-2]。HPV在女性育齡人群中的攜帶率較高(約為10%)，性傳播及密切生活接觸是其主要的傳播途徑[3]。

近年來國內外有文獻報道了HPV感染對育齡人群生育力的影響[4-5]，但對接受輔助生殖技術(ART)治療的不孕不育人群的感染情況及其對妊娠結局影響的報道仍較少，尤其是供精人工授精(artificial insemination by donor，AID)助孕患者。本研究回顧了近5年來在山西省生殖科學研究所生殖醫學中心接受AID治療的女性患者HPV感染情況，并通過歸納分析探究HPV感染對AID妊娠結局的影響。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2014年1月至2019年6月在本所生殖醫學中心接受AID治療的824例女性患者的1 834個AID治療周期的病例資料。納入標準：男方因素導致的不育，包括：不可逆的無精子癥(如先天性無睪丸、隱睪、輸精管缺如)、嚴重少弱畸精子癥、不宜生育的嚴重遺傳性疾病等；女方至少一側輸卵管暢通；無排卵障礙。排除標準：女方高齡(>40歲)；子宮內膜炎、治療過程中出現中重度盆腔炎癥等；內分泌異常，如基礎性激素水平、甲狀腺功能異常等。根據女方HPV感染情況，將上述研究對象分為兩組：HPV陽性組共85例(184個周期)與HPV陰性組共739例(1 650個周期)。接受AID治療前，夫婦雙方均知情同意并簽署相關知情同意書。

二、研究方法

1.HPV檢測：進入治療周期前的1個月內進行檢測。檢測方法為PCR-反向點雜交法。檢測的HPV型別有：高危型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59型)、疑似高危型(53、66、68、73、82、83型)和低危型(6、11、42、43、81型)。采用專門的宮頸脫落細胞采集器進行采樣，采樣后對含脫落細胞的宮頸黏液進行處理，提取HPV DNA，經PCR擴增、產物雜交、洗膜、顯色等步驟后，通過膜條上各探針區域的顯色情況判讀受檢者的HPV感染情況。所用檢測試劑盒由深圳亞能生物技術有限公司提供，所有操作全部按照試劑盒內說明書進行。

2.治療方案：根據女方排卵情況，選擇自然周期或卵巢微刺激方案。卵巢微刺激方案主要包括氯米芬(CC，高特制藥，塞浦路斯)/人絕經期尿促性腺激素(HMG，珠海麗珠制藥)+人絨毛膜促性腺激素(HCG，珠海麗珠制藥)或CC+HMG+HCG方案。一般自月經第10天左右開始，通過陰道B超監測卵泡發育情況，直至優勢卵泡破裂。

3.供精精液選擇及處理：所用的供精精液全部來自于山西省人類精子庫。依據“血型一致(即供精者與男方患者血型一致)”、“1∶5(即每位供精者精液最多只能使5名女性受孕)”、“每周期使用同一供精者精液”的原則，為患者隨機分配精液(1 ml×2支)。患者同意使用后，將裝在凍存管中的精液從液氮中取出，置于37℃水浴箱中復蘇10 min。復蘇后通過雙層密度梯度離心法進行處理。處理后精子懸液體積調至0.5～0.6 ml。

4.人工授精：分為排卵前、后雙次授精和排卵后單次授精。雙次授精：當B超顯示優勢卵泡未破但患者尿LH呈陽性，或者人工注射HCG后的當日(一般為HCG后3 h內)行第1次授精，待B超確認卵泡破裂后行第2次授精；單次授精：B超確認優勢卵泡破裂后的24 h內，將2支精液同時處理后進行授精。人工授精后均給予黃體支持(地屈孕酮10 mg/次，2次/d，口服2周)。

5.妊娠確認：患者于人工授精術后的第14天來院抽血化驗β-HCG，確定生化妊娠情況；第35天來院行B超檢查，確定臨床妊娠情況，并于孕18周繼續來院檢查，明確胎兒發育情況。

6.觀察指標：(1)患者一般情況：女方年齡、HPV感染情況、不孕類型及不孕年限、治療方案、實施周期數；(2)治療相關參數：優勢卵泡數、處理前后精子濃度與前向運動精子比例、授精日子宮內膜厚度、授精方式；(3)周期妊娠結局：臨床妊娠率、生化妊娠率、流產率、異位妊娠率、活產率、持續妊娠率。

三、統計學處理

結 果

一、HPV感染情況

納入研究的824例女性患者中HPV感染者85例，占10.3%；HPV未感染者739例，占89.7%。其中70例為單一型感染，15例為多型混合感染。單一型感染中高危型(包括疑似高危型)感染60例，占總感染數的70.6%；低危型感染10例，占總感染數的11.8%。混合感染中，高危型感染11例，占總感染數的12.9%，其中大部分為2個型別的感染，少數為3個及3個以上型別的感染，另有4例為低危型與高危型的混合感染，占總感染數的4.7%。高危型中，感染率最高的為16型(17/85，20.0%)，另一常見高危型18型的感染率較低(3/85，3.5%)，不常見的高危型51型(9/85，10.6%)、52型(12/85，14.1%)、58型(9/85，10.6%)和疑似高危型53型(9/85，10.6%)的感染率較高；低危型中，主要涉及的型別有6型(3/85，3.5%)、42型(5/85，5.9%)和81型(5/85，5.9%)等，其中42和81型檢出率最高，未發現2種及以上低危型的混合感染。

二、兩組患者一般資料及治療情況比較

除HPV感染情況外，AID患者涉及的其它可能影響妊娠結局的重要因素有：女方年齡、不孕年限、不孕類型、治療方案、實施周期數、平均優勢卵泡數、授精次數、精液指標、子宮內膜情況等。經t檢驗及χ2檢驗，以上各參數在HPV陰性組及HPV陽性組間的差異均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 患者一般資料及治療情況比較[(-±s)，%]

三、兩組患者AID妊娠結局比較

納入研究的1 834個AID周期中，HPV陰性組患者實施周期數為1 650個，HPV陽性組患者實施周期數為184個，HPV陽性組臨床妊娠率和總流產率略高于HPV陰性組，尚無顯著性差異(P>0.05)；按照流產時間進行細分后，HPV陽性組晚期流產率顯著高于HPV陰性組(P<0.05)，早期流產率及其它妊娠結局指標兩組間比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組患者妊娠結局比較(%)

討 論

人類ART運用至今，已發展到胚胎植入前遺傳學檢測(PGT)乃至卵胞漿置換技術的階段，但人工授精術以其操作簡便、幾乎無創、費用較低等優勢，仍然是臨床首選的一線助孕方案[6]。尤其是上世紀80年代末，人類精子庫和AID技術應運而生，解決了不可逆性無精子癥和嚴重染色體異常等問題患者的合法生育需求。目前人工授精的周期臨床妊娠率一般在10%～20%之間，且受諸多因素影響[7-8]。研究已證實其主要影響因素有：女方年齡、不孕年限、治療方案、排卵情況(優勢卵泡數)、精子質量(活力、濃度)等[7-9]。此外，子宮內膜情況、授精時機及次數、病原體感染情況等作為臨床妊娠率的潛在影響因素也有報道，但結論并不一致[10-12]。

目前納入人工授精術前常規檢查的病原體檢查項目有解脲支原體、沙眼衣原體、優生十項(TORCH)、HBV、HCV、HIV、梅毒、淋球菌等。關于這些病原體對人工授精妊娠結局影響的研究報道較少。與之相比，HPV雖未被列入人工授精術前的必查項目，但其對人工授精、體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的妊娠結局都有顯著的不利影響。Depuydt等[13]通過對590名女性的1 529個夫精人工授精(AIH)周期的回顧性分析發現，HPV感染者的臨床妊娠率約為未感染者的1/6(1.87% vs.11.36%，P=0.004 1)；2019年，Depuydt等[14]又通過對877個AIH周期和485個AID周期的回顧性分析，再次確認HPV感染可導致人工授精臨床妊娠率顯著下降。Garolla等[15]亦研究發現HPV感染可明顯降低人工授精與IVF-ET的活產率并增加流產率。一些系統評價與meta分析也得出相似結論[4-5，16]。更有臨床研究顯示，不論接受IVF-ET治療的夫婦任何一方感染HPV，都可帶來至少40%的流產率，而當雙方同時感染HPV時，流產率可達100%[17]。

本研究中，接受AID治療的824名女性中HPV的感染率為10.3%，與其他文獻報道的結論[3]相似。具體分析，呈現出“高危為主、型別多樣”的感染特點。高危型中，感染率最高的為16型，這也是臨床最早發現、最常見、研究最多的HPV型別[1]。除16型外，另一較常見、報道較多的高危型18型在本研究患者中感染率較低，但是51、52、53、58等型別感染率較高，其原因還有待進一步的流行病學研究。低危型呈現出“感染率低、型別單一”的特點，未發現2種及以上低危型的混合感染。

從妊娠結局來看，HPV陽性組臨床妊娠率略高于HPV陰性組，活產率及持續妊娠率略低于HPV陰性組，但均無顯著性差異(P>0.05)。不良妊娠結局中，除異位妊娠率和生化妊娠率外，其余指標HPV陽性組均高于HPV陰性組，其中晚期流產率HPV陽性組顯著高于HPV陰性組(6.9% vs.0.9%，P=0.007)。雖然本研究中兩組研究對象的樣本量相差較大可能會對研究結果產生一定影響，但對HPV感染之外的各項妊娠結局影響因素進行二分類統計檢驗，結果顯示HPV陽性組與HPV陰性組間各項參數指標均在正常范圍，差異也均無統計學意義(P>0.05)。因此之前提到的女方年齡、不孕年限、排卵情況等因素均未給HPV陽性組與HPV陰性組妊娠結局帶來明顯影響，對結果的統計分析影響亦較小。提示在忽略樣本量及其它未知影響因素的情況下，女方HPV感染有降低活產率、增加流產率的風險，尤其是晚期流產率，繼而影響AID妊娠結局。2006年Henneberg等[18]通過鼠胚實驗證實，暴露在16及18型HPV DNA下的二細胞胚胎無法繼續發育至囊胚，若從四細胞階段開始暴露，雖有一部分胚胎可以繼續發育，但大部分胚胎的發育仍受到阻滯。但本研究中除16、18型外，尚有51、52、58等多個高危型也具有較高的感染率，這些型別是否與AID術后流產存在明確的關聯性，以及多型混合感染是否會進一步增加流產的風險，目前尚無相關文獻報道，仍需進一步研究。此外，部分動物及人細胞水平的體外研究結果顯示，HPV感染導致流產率增高可能與使用攜帶HPV的精子授精有關[2，4，15]，但由于缺少體內研究結果，目前尚無統一結論。另一方面，這些體外的分子或細胞研究也無法闡明母體HPV感染作用于胎兒發育的具體階段。雖然其具體機制尚待明確，但本研究結果至少提示有HPV感染及既往感染(尤其高危型)的女性在接受助孕治療期間應定期關注HPV感染的進展、復發情況，通過人工授精獲得臨床妊娠后，應密切關注胎兒的發育情況。

綜上所述，HPV感染具有“高危為主、型別多樣”的特點，作為一個風險因素，可明顯增加AID術后的晚期流產率。但其影響AID妊娠結局的具體機制仍需進一步深入研究。