粒細胞集落刺激因子對IVF-ET拮抗劑方案鮮胚移植妊娠結局的影響

茹慧波，董九華，王琇，張亦心，杜麗榮

(河北省計劃生育科學技術研究院 國家衛生健康委員會計劃生育與優生重點實驗室 河北省生殖醫學重點實驗室，石家莊 050071)

促性腺激素釋放激素拮抗劑方案(拮抗劑方案)在輔助生殖技術(ART)的臨床實踐中以其周期治療時間短、符合生理過程的優勢在控制性促排卵中受到重視[1]。雖然有Meta分析認為拮抗劑方案與激動劑長方案的妊娠結局基本一致，但還有不少研究認為兩者間存在一定差異[2]。近年臨床實踐中發現拮抗劑方案新鮮周期移植的著床率和妊娠率均低于激動劑方案[3]，因此臨床上準備鮮胚移植的患者會避免采用拮抗劑方案，而采用拮抗劑方案促排卵的患者往往會行全胚冷凍后再解凍移植。研究證實，當獲卵數小于15枚時，全胚冷凍后解凍移植的臨床結局并不優于新鮮周期移植[4]。此外，實施全胚冷凍+凍融胚胎移植(FET)不僅延長了患者獲得妊娠的時間，增加患者的焦慮情緒，而且增加了FET周期的經濟費用。因此，如何提高拮抗劑方案鮮胚移植妊娠率是現在研究熱點之一。粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是正常妊娠生理過程中調節子宮內膜免疫細胞功能的重要細胞因子之一，在母胎界面有著重要的調節作用。研究已證明G-CSF可參與調節子宮內膜血管重塑、局部免疫調控及細胞粘附系統，調節子宮內膜容受性，包括子宮內膜厚度、腔上皮、腺上皮、間質的發育狀態及子宮內膜的血流灌注情況[5]。研究發現G-CSF可以提高反復移植失敗IVF患者的妊娠率[6]。本研究旨在探討拮抗劑方案鮮胚移植患者移植時使用G-CSF能否改善其妊娠結局。

資料及方法

一、研究對象及分組

本研究經河北省計劃生育科學技術研究院倫理委員會審批通過后，招募2018年1月至2019年10月于我院采用拮抗劑方案行IVF-ET治療的患者，嚴格按照納入和排除標準篩選，經與患者充分溝通討論實驗對妊娠率的影響和藥物可能的副作用等，患者夫婦知情同意并簽署相關知情同意書后，采用完全隨機分組研究的方法和要求，按照SPSS軟件提供的完全隨機數字表，遵循完全隨機原則分配為治療組和對照組，每組各50例。

納入標準：20～40歲不孕患者；促排卵方案為拮抗劑方案；新鮮周期移植。

排除標準：對G-CSF過敏者以及對大腸桿菌表達的其他制劑過敏者；既往惡性腫瘤、血液系統疾病病史者，尤其是骨髓中幼稚粒細胞未顯著減少的骨髓性白血病或外周血中檢出幼稚粒細胞的骨髓性白血病。

二、研究方法

1.輔助生殖治療：采用靈活GnRH拮抗劑方案促排卵，于月經第2～3天進周期，促性腺激素(Gn)初始量依年齡、基礎激素水平、基礎竇卵泡數、抗苗勒管激素(AMH)水平、體重指數(BMI)及既往促排結局等綜合評價，啟動量為150～300 U/d，視卵泡發育情況及血FSH、LH、E2、P水平及時調整Gn的用量和卵泡監測時間；B超監測發現有1個以上卵泡直徑達到14 mm或者LH≥4 U/L或者E2≥1 500 pmol/L時開始加用注射用醋酸西曲瑞克(思則凱，默克雪蘭諾，法國)0.125～0.25 mg，直至扳機日。當1～2個主導卵泡平均直徑≥18～20 mm或>16 mm主導卵泡占比大于60%時，使用重組HCG(艾澤，默克雪蘭諾，西班牙)250 μg 聯合HCG(珠海麗珠醫藥)2 000～5 000 U扳機，36 h后經陰道超聲引導下穿刺取卵。移植前行胚胎質量評分，按照胚胎標準評分選取1～2枚第3天卵裂期胚胎進行移植，且至少1枚為優質胚胎。優質胚胎根據人類體外受精-胚胎移植實驗室操作專家共識中[7]定義為I級、II級胚胎。

2.對照組用藥：移植后常規黃體支持，陰道用黃體酮陰道緩釋凝膠(雪諾同，默克雪蘭諾，英國)90 mg，每天一次；芬嗎通(雅培，荷蘭)黃片(2 mg/片)1片，口服，每日2次。

3.治療組用藥：移植日開始給予G-CSF注射液(吉賽欣，華北制藥漢坦生物技術)150 μg，皮下注射，隔日一次，共注射5次，并隨訪觀察用藥期間有無不良反應。其余用藥同對照組常規黃體支持。

4.妊娠結局判斷：移植14 d測血β-HCG>5 U/L為HCG陽性；HCG陽性但經陰道B超于宮內及宮外均未探及明顯孕囊或期間月經來潮，復查HCG值下降或轉陰診斷為生化妊娠；陰道超聲探及孕囊，或者流產組織病理檢查提示為絨毛組織者診斷為臨床妊娠。臨床妊娠者記錄孕囊個數和妊娠結局。

三、觀察指標及判定標準

兩組患者一般資料(年齡、不孕年限、不孕類型、既往助孕周期數、BMI、基礎激素水平)；促排卵情況(Gn天數、Gn用量、獲卵數、MⅡ卵數)；胚胎培養情況(受精率、正常受精率、可利用胚胎數、優胚數)；胚胎移植情況及妊娠結局(子宮內膜厚度/分型/血流、移植胚胎數、移植優胚數、HCG陽性率、臨床妊娠率、早期流產率、胚胎種植率)。

胚胎種植率=總孕囊數/移植總胚胎數；HCG陽性率=HCG陽性例數/總移植周期數；臨床妊娠率=臨床妊娠例數/總移植周期數；流產率=流產人數/臨床妊娠人數。

四、統計學分析

結 果

一、患者一般情況比較

隨機入組患者每組各50例，因內膜因素、胚胎因素、患者意愿等原因取消移植17例，最終將治療組41例、對照組42例相關數據納入統計分析。兩組患者間年齡、不孕年限、基礎激素水平等一般情況比較均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者一般情況比較[(-±s)，n(%)]

二、患者IVF-ET情況比較

1.促排卵、受精及胚胎培養情況比較：兩組患者間Gn天數/用量、獲卵數等比較均無統計學差異(P>0.05)；兩組間正常受精率、可利用胚胎數及優胚數比較亦無統計學差異(P>0.05)(表2)。

2.移植前子宮內膜情況比較：兩組患者間移植前子宮內膜厚度、分型、血流比較，差異均無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表2 兩組患者促排卵、受精及胚胎培養情況比較[(-±s)，%]

表3 兩組患者移植前子宮內膜情況比較[(-±s)，n(%)]

3.胚胎移植及妊娠結局比較：兩組患者間移植胚胎數目、移植優胚數等比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；G-CSF治療組HCG陽性率、臨床妊娠率、胚胎種植率均顯著高于對照組(P<0.05)，但兩組間早期流產率比較差異無統計學意義(P>0.05)(表4)。

三、兩組患者胚胎移植14 d時β-HCG水平比較

兩組患者移植14 d時β-HCG水平比較，兩組HCG陽性者β-HCG水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，臨床妊娠者亦然(P>0.05)。考慮到單胎與雙胎分泌β-HCG差異，兩組單胎妊娠者β-HCG水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，雙胎妊娠者亦然(P>0.05)(表5)。

表4 兩組患者胚胎移植及妊娠結局比較[(-±s)，%]

表5 兩組患者胚胎移植14 d時不同妊娠結局者β-HCG水平比較(-±s)

四、不良反應

治療組中發現15例使用G-CSF后白細胞輕度升高(后復查正常)、1例失眠，未發現其他不良反應(如發熱、頭痛、皮膚異常和肝腎功異常等)以及嚴重不良反應。

討 論

輔助生殖技術(ART)在不孕癥患者中的運用日趨完善，控制性促排卵的方法也在摸索中前進。促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長方案是經典的鮮胚移植的促排卵方案，妊娠率穩定，但是存在周期時間長、容易發生卵巢過度刺激綜合征(OHSS)等缺點，于是GnRH拮抗劑方案在臨床實踐中應運而生，并以其周期治療時間短、更加符合生理過程的優勢在控制性促排卵中占有越來越重要的地位。Grow等[8]回顧性分析ART中卵巢正常反應患者，發現拮抗劑方案與長方案患者相比，子宮內膜容受性較差、種植率和活產率較低。陳崢屹等[9]認為拮抗劑具有溶黃體作用，導致拮抗劑方案中存在黃體功能不足的情況，影響妊娠結局。其他研究也發現拮抗劑方案胚胎著床率低于GnRH-a長方案，并認為拮抗劑可能影響子宮內膜容受性而使胚胎著床率降低[2-3]。李宣等[1]等認為過低的LH水平可能與拮抗劑對內源性LH的過度抑制有關，從而通過影響子宮內膜容受性等環節，進一步影響臨床妊娠結局，而合理控制HCG日LH水平可能有利于拮抗劑方案鮮胚移植臨床結局。由此可見拮抗劑方案鮮胚移植妊娠率下降備受臨床醫生的關注。

對于如何改善拮抗劑方案的妊娠結局，生殖醫生也進行了大量研究工作。Copperman等[10]認為反向添加重組人LH(rLH)可對抗大劑量拮抗劑引起的LH耗竭，從而提高妊娠率。徐蓓等[11]研究表明拮抗劑方案不宜延遲扳機，尤其對于如Gn使用時間較長或孕酮水平高于1 ng/ml(3.17 nmol/L)時，以防扳機時機后延致內膜發育不同步，從而影響妊娠結局。對于拮抗劑方案鮮胚移植患者，是否需要加強黃體支持及如何進行黃體支持尚無定論，常用方法為加強補充雌/孕激素和雙扳機或取卵日添加HCG，而GnRH-a作為新型的黃體支持藥物仍存在爭議。如何提高拮抗劑方案鮮胚移植的妊娠率有待進一步研究。

目前生殖免疫學是生殖領域新的交叉學科與研究熱點。G-CSF于1983年首次在小鼠體內發現，其為一種分子量約為2萬的糖蛋白，屬于骨髓造血細胞的增殖因子，可以廣泛作用于骨髓微環境，其受體在多種髓系細胞表面均有表達，還可見于內皮細胞、胎盤細胞、滋養細胞、胎母細胞界面和顆粒黃體化細胞等[12-14]。胚胎種植是個復雜的過程，免疫細胞在子宮內膜容受性中發揮著重要作用，成功植入及妊娠需要免疫平衡[15]。學者認為G-CSF在窗口植入期可抑制機體對胚胎發動的免疫攻擊，使子宮內膜具有足夠的容受性幫助胚胎著床[16]。G-CSF還可以通過增加白細胞介素-10(IL-10)和轉化生長因子-β等趨化因子的分泌，誘導Th-2免疫應答，參與胚胎著床期間子宮內膜的成熟[17]。徐士儒等[18]發現拮抗劑方案可顯著上調子宮內膜各免疫細胞的陽性細胞率，提示免疫細胞可能影響子宮內膜容受性。

臨床研究方面，Aleyasin等[6]在一項多中心隨機對照試驗中評價全身單劑量皮下G-CSF給藥對不孕女性IVF-ET成功率的影響，干預組在胚胎移植前1 h皮下注射G-CSF 300 μg，發現該方法顯著增加反復種植失敗(RIF)患者的妊娠率。Zhang等[19]的Meta分析發現G-CSF通過局部宮腔灌注與皮下注射兩種途徑對胚胎移植的臨床結局有著積極的影響。既往眾多研究通過宮腔灌注G-CSF改善子宮內膜容受性，治療薄型子宮內膜，提高胚胎植入率與臨床妊娠率[20-21]。由此可見，通過局部宮腔灌注與皮下注射兩種方法均可對胚胎移植的妊娠結局產生影響，鑒于鮮胚移植周期不適宜宮腔灌注的方法，本中心采用移植后皮下注射G-CSF，統計分析發現G-CSF治療組HCG陽性率、臨床妊娠率及胚胎種植率顯著優于對照組，與既往研究結果相一致。我們進一步將對照組與治療組妊娠后不同妊娠狀態下的血清β-HCG水平進行比較，探索G-CSF是否可通過生化學指標來反應滋養細胞的功能變化，結果發現兩組間HCG陽性者、臨床妊娠者、單胎妊娠者、雙胎妊娠者的移植后14 d血清β-HCG水平均無統計學差異。需要進一步尋找其它指標來驗證G-CSF改善妊娠結局的途徑。

G-CSF在IVF-ET拮抗劑方案鮮胚移植過程中使用，可以改善妊娠結局。該方法可為臨床提高拮抗劑方案鮮胚移植妊娠率提供新思路，但其作用機制尚需進一步研究。G-CSF對子宮內膜蛻膜化的調節可能是通過G-CSF數量的改變來控制不同類型的分泌細胞數量，從而使內膜分泌的各種生物活性因子達到更利于胚胎植入的狀態[22]，進而達到改善妊娠結局的作用。但本研究缺乏相關指標的測定來驗證猜想，后期的研究設計應同時測定血清細胞因子，以進一步確定其作用機制。此外本研究樣本量偏少，將來應設計大樣本或多中心的臨床研究來避免因樣本量造成的結果偏倚。