不同磷源對釀酒酵母發酵代謝產物的影響

饒軼晟，胡國濤*，王鳳霞，張 紅，吳雪君，劉黔霞

（1.中低品位磷礦及其共伴生資源高效利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550016；2.甕福 （集團）有限責任公司，貴州 貴陽 550000）

碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽、水分六大營養物質為微生物提供了生長繁殖和代謝的條件，并為合成產物提供相應的營養物質基礎［1］。無機鹽主要可為微生物提供除碳源、氮源以外的各種重要元素，在微生物發酵的作用是構成菌體細胞成份，作為酶的組成部分、酶的激活劑或抑制劑，調節培養基的滲透壓、pH、氧化還原電位等，對發酵菌體的影響效果雖不及碳源和氮源，但適量的添加可促進菌體健康快速的生長繁殖提高其代謝產物量［2］。磷常以磷酸鹽的形式加入到培養基中，據市場調研，在微生物發酵工業化生產過程中，考慮到用量大，混合難度等問題，大部分微生物發酵廠家多使用食品級磷酸代替磷酸鹽。因此，磷酸對微生物生長及發酵具有重要作用。

磷酸是一種常見的無機酸，屬于中強酸，可廣泛應用于洗滌、食品、制藥、顏料、電鍍、防銹等行業。 《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》［3］（GB2760-2014）中食品工業用加工助劑使用中明確規定，磷酸可作為食品工業用加工助劑（發酵用營養物質）在發酵工藝上使用，因此本文特將磷酸作為發酵營養物質磷源使用。為探究磷源對釀酒酵母發酵的影響，本試驗選取了釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Hansen）作為培養對象進行相關試驗。

1 實驗部分

1.1 原料及試劑

試驗菌種：釀酒酵母菌 （Saccharomyces cerevisi-ae Hansen）。

試劑：食品添加劑磷酸 （85%）、酵母粉、蛋白胨、磷酸二氫鉀、瓊脂、硫酸銨、氯化鈉、氫氧化鈉、葡萄糖、氫氧化鉀等，以上試劑均為分析純。

培養基及試劑：培養基參照 《微生物學實驗教程 （第四版）》［4］進行配制。YPD基礎培養基、YPD磷酸鹽培養基 （在基礎培養基中添加磷酸二氫鉀10 g）、YPD磷酸培養基 （在基礎培養基中添加磷酸8.46 g，氫氧化鉀4.2 g）。固體培養基配制：按照以上配方，每1000 mL培養基中加入20 g瓊脂即可。1mg／mL葡萄糖標準液、DNS顯色液參照文獻［5］進行配制。

1.2 主要儀器和設備

BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋、DHP-9052B型恒溫振蕩培養箱、帶紫外燈超凈工作臺、DB-XAB型石墨電加熱板、PE Lambda722型紫外可見分光光度計等。

1.3 實驗方法

1.3.1 釀酒酵母發酵

采用液體發酵進行試驗。根據試驗需要配置基礎YPD、添加磷酸鹽的YPD、添加食品添加劑磷酸的YPD培養基，并在該三種培養基接種同等菌含量的酵母菌，待發酵72h后判斷三種培養基對酵母菌發酵的影響。詳細試驗過程參照文獻［6-7］進行。

1.3.2 檢測方法

1.3.2.1酵母菌發酵能力檢測［8］

分別取各液體發酵培養基250.00 g于500 mL三角錐瓶中，滅菌后接種酵母種子液4%，精確稱量總質量后于30℃振蕩培養72 h后稱量發酵液重量，每組培養基6個重復。因每瓶液體發酵培養質量及接種量相同，因此測單位時間內發酵液失重量為二氧化碳的產生量即可反應發酵能力。

1.3.2.2 發酵液殘糖量測定［5］

將1.3.2.1培養72 h的發酵液于5000 r／min離心10 min，取上清進行殘糖量檢測。酒精度作為釀酒酵母發酵能力最重要的指標，與酵母糖轉化利用率相對應，糖轉化利用率高則相應酒精度高，反之糖轉化利用率低則相應酒精度低［9］。

1.3.2.3 產酒精量測定［10］

取1.3.2.2 已離心的發酵液，過0.22μm無菌有機系濾膜。過濾完的液體即為待測樣品。檢測參照GB／T13662-2008，黃酒中酒精含量檢測方法進行。

1.3.2.4 總酸、氨基酸態氮測定［10］

檢測參照GB／T13662-2008檢測方法進行。酒中的酸類物質作為主要的呈味成分，以總酸含量用來判定酵母產酸能力，具有一定依據。且酒含有的多種氨基酸，能被酵母進一步代謝生成重要風味物質高級醇［9］，因此也作為酵母發酵能力的一項重要指標。

1.3.4 數據處理方法

采用SPSS17.0軟件進行數據分析，多重比較（LSD）確定組間差異，結果以 “均值±標準誤”表示，EXCEL軟件作表。

2 結果與分析

釀酒酵母發酵試驗結果見表1。

表1 釀酒酵母發酵試驗結果

由表1可知，1＃、2＃、3＃培養基中釀酒酵母發酵產生的二氧化碳含量分別為9.67、11.12、11.65 g／L，說明培養基中添加適量磷酸及磷酸鹽與基礎培養基相比能夠產生更多的CO2，且磷酸鹽與磷酸的CO2產生量略有差異但不顯著，由此可知在培養基中添加適量的磷酸鹽或磷酸均能夠提高酵母菌的發酵能力。發酵液中殘糖量可以反應酵母對糖的轉化利用能力，試驗初始培養基中含糖量相同，發酵結束后殘糖量低，說明酵母對糖的轉化利用率高，則說明發酵能力強。1＃、2＃和3＃培養基殘糖量分別為18.08、10.16、8.627 g／L，說明2＃和3＃培養基中酵母對糖的轉化利用率比1＃高；發酵液中酒精度 （體積分數）分別為3.75%、4.21%、4.47%，1＃相對2＃和3＃培養基酒精度較低；而2＃和3＃則沒有顯著性差異；總酸分別為：4.37、5.13、5.15 g／L；氨基酸態氮分別為0.72、0.83、0.85 g／L，1＃和2＃、3＃培養基之間存在顯著性差異，2＃和3＃培養基之間無顯著性差異。由此可說明培養基中添加磷酸鹽和磷酸均能促進酵母菌發酵，且磷酸鹽與磷酸的效果無顯著性差異。

3 結語

通過在釀酒酵母發酵培養基中不添加磷源、以磷酸鹽形式添加磷源、以磷酸形式添加磷源，發酵72 h后各培養基中二氧化碳產生量、殘糖量、產酒精量、發酵液中總酸和氨基酸態氮生成量等指標的變化來判斷磷源對釀酒酵母發酵的影響。由試驗數據可知添加磷源，可提高釀酒酵母發酵能力；而以磷酸鹽形式和以磷酸形式添加磷源，都能夠為釀酒酵母發酵提供磷源，且促進發酵的效果一致。