小反芻獸疫病毒RT-nPCR檢測方法的建立

朱小甫，吳旭錦

(咸陽職業技術學院 畜牧獸醫研究所，咸陽市動物疫病分子生物學診斷技術研究重點實驗室，陜西 咸陽 712000)

小反芻獸疫(PPR)是一種嚴重危害羊和小反芻野生動物的烈性傳染病，臨床特征為體溫升高、口腔炎癥、肺炎和腹瀉[1]。PPR在我國屬于一類動物疫病[2]。PPR病原為小反芻獸疫病毒(PPRV)，該病毒屬于副黏病毒科、麻疹病毒屬，目前發現PPRV只有1個血清型[3]。2007年，PPR疫情在我國西藏初次發現，隨后該病在我國部分省份零星發生，提示我國急需做好PPR防控工作[4～6]。PPRV的準確診斷是防控工作的重要內容之一，開發靈敏特異的快速診斷方法尤為重要。

已知用于檢測PPRV的方法有瓊脂擴散試驗、對流免疫電泳和ELISA等，現行國標GB/T27982-2011《小反芻獸疫診斷技術》中規定實驗室診斷方法有病毒分離鑒定、RT-PCR和熒光定量RT-PCR反應[7～9]。其中病毒分離鑒定消耗時間長，最終還要依靠RT-PCR或熒光定量RT-PCR鑒定；熒光定量RT-PCR設備昂貴、試劑耗材價格高。套式PCR方法能夠大幅度提高檢測的靈敏度[10,11]，對病毒早期感染的診斷具有重要意義，本研究旨在建立一種高靈敏度的小反芻獸疫RT-nPCR方法，為PPR疫情防控提供參考。

1 材料

1.1 主要試劑

RNAiso Reagent、DNAiso核酸提取試劑、M-MLV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、rTaq酶、dNTP、DL-2 000 Marker等，均購自大連寶生物。

1.2 主要儀器

PCR儀(型號為ProFlex)，購自美國ABI公司；高速冷凍離心機(型號為5424R)，購自德國艾本德公司；超微量紫外-可見光分光光度計(型號為NanoDrop one)，購自美國Thermo公司。

1.3 參考病毒

PPRV參考毒株為商品弱毒疫苗；羊口瘡病毒由西北農林科技大學動物免疫研究室分離惠贈；山羊痘疫苗、口蹄疫疫苗和藍舌病毒雞胚化弱毒疫苗為市售商品苗。

1.4 病料和血清

本課題組采集或羊場送檢的疑似組織病料共6份，包括肺、脾、肝和腎，研磨處理，12 000 g離心10 min，收集上清液；采集血液分離血清共22份。樣品置-70 ℃保存，備用。

2 方法

2.1 引物設計與合成

根據GenBank上公開的PPRV基因序列KM091959、FJ905304，針對F基因設計了2對引物，由上海生工合成，稀釋到工作濃度20μmol·L-1，引物詳細信息見表1。

2.2 PPRV RNA的提取和cDNA的合成

取PPRV弱毒疫苗液250 μL，按照RNAiso Reagent操作說明提取RNA，RNA干燥后管中加入DEPC水10.5 μL，引物PPRV-1F 1 μL，dNTP 4 μL，5×Buffer 4 μL，M-MLV 0.25 μL，RNA酶抑制劑 0.25 μL，總體積20 μL，反復吹打溶解RNA，置37 ℃水浴中反應60 min，測定cDNA濃度。

表1 引物基本信息

2.3 PPRV RT-nPCR方法的建立

以cDNA為模板，第1次PCR體系：cDNA 2 μL，10×PCR緩沖液 2.5 μL，dNTP 2 μL，PPRV-1F/PPRV-1R各0.5 μL，調整rTaq酶用量(0.25～1 μL)，用超純水補足總體積25 μL。第1次擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s變性，退火溫度(50 ℃～60 ℃)按1 ℃遞增持續40 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環；72 ℃再延伸5 min。第2次PCR體系：第1次擴增產物2 μL，10×PCR緩沖液 2.5 μL，dNTP 2 μL，PPRV-2F/PPRV-2R各0.5 μL，調整rTaq酶用量(0.25～1 μL)，用超純水補足總體積25 μL。第2次擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s變性，退火溫度(55～60 ℃)按1 ℃遞增持續30 s，72 ℃ 延伸40 s，共30個循環；72 ℃再延伸5 min。確定最佳擴增體系和擴增程序。

2.4 PPRV RT-nPCR方法靈敏度測定

將cDNA溶液按照10倍濃度梯度進行稀釋，共9個稀釋度，以各濃度cDNA為模板，按優化的體系條件進行反應，分別對第1，2次擴增產物進行電泳觀察，明確檢測靈敏度極限。

2.5 PPRV RT-nPCR方法特異性測定

按照上述RNA提取方法獲得PPRV、羊口瘡病毒(ORFV)、口蹄疫病毒(FMDV)和藍舌病病毒(BTV)RNA，用DNAiso提取山羊痘病毒(GPV)DNA，以建立的方法進行反應驗證。

2.6 臨床樣品PPRV的檢測

用建立的RT-nPCR方法對收集的28份組織病料和血清進行檢測，驗證方法的實用性。

3 結果與分析

3.1 PPRV RT-nPCR檢測方法的建立

通過調整酶用量和退火溫度確定了最佳PCR擴增體系和擴增程序，第1次擴增體系(總體積為25 μL)：cDNA 2 μL，超純水17 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，PPRV-1F/PPRV-1R各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶0.5 μL。第1次擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共35個循環；72 ℃再延伸5 min。第2次擴增體系(總體積為25 μL)：第1次擴增PCR產物 2 μL，超純水17 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，PPRV-2F/PPRV-2R各0.5 μL，rTaq DNA聚合酶0.5 μL。第2次擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35個循環，72 ℃再延伸5 min。

3.2 PPRV RT-nPCR檢測方法的靈敏性

測定反轉錄第一鏈cDNA含量為436.2 ng·μL-1，10倍梯度稀釋后進行擴增，電泳圖顯示，第1次擴增檢測的極限為4.362 ng·μL-1(見圖1)，第2次擴增檢測的極限為4.362×10-5ng·μL-1(見圖2)。套式PCR檢測將靈敏度提高了10萬倍。

3.3 PPRV RT-nPCR檢測方法的特異性

用所建立的方法對PPRV和常見的4種羊傳染病病毒進行檢測，結果顯示，僅有PPRV出現395 bp特異性條帶，羊口瘡病毒、山羊痘病毒、口蹄疫病毒和藍舌病病毒均未出現條帶(見圖3)。結果證實建立的方法能特異準確的擴增PPRV核酸片段。

3.4 病料中PPRV的檢測

28份臨床樣品檢測結果有4份樣品為陽性，陽性率14.3%。部分樣品檢測見圖4。

4 討論

PPRV共編碼6種結構蛋白，檢測的靶標基因主要有N、M和F等基因。N蛋白為核蛋白，毛立等[8]根據GenBank公開的N基因設計引物，參考肌動蛋白基因序列設計內參引物，建立了一種小反當獸疫RT-PCR檢測方法，靈敏度試驗表明，該方法檢測病毒RNA的極限為12 TCID50/mL。Balamurugan等[12]基于PPRV N和M基因建立了一步多重PCR方法，在一個擴增體系中同時進行N和M基因的克隆，可在感染動物眼、鼻拭子中檢出100 fg的PPRV核酸。F蛋白是融合蛋白，與病毒的吸附侵入細胞有關[13]。依據PPRV的F基因可將PPRV流行毒株分為4個基因系，因而F基因是PPRV分子流行病學調查的首選基因[14]。筆者研究針對F基因，通過比對公開發表的PPRV F基因序列，選擇高保守部位設計了外擴、內擴2對引物，建立了RT-nPCR檢測方法。該方法第1對引物檢測cDNA的極限為4.362 ng·μL-1，第2對引物二次擴增后檢測的極限為4.362×10-5ng·μL-1，靈敏度提高100 000倍，極大地提升了檢測模板濃度的下限，對早期感染、隱性感染等病毒拷貝數較低的病例檢測具有重要意義。特異性試驗結果表明，設計的方法檢測常見的羊口瘡病毒、山羊痘病毒、口蹄疫病毒和藍舌病病毒均未出現條帶，滿足臨床應用要求。臨床疑似病例的組織與血清檢測，發現存在感染PPRV樣品，提示羊場需要做好防控工作。