四甲基戊二酸對蛹蟲草生長發育的影響

賀立虎，房海珍，李娟麗，薩達提·吾買爾

(1.楊凌職業技術學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西西鳳酒股份有限公司，陜西 鳳翔 721406;3 新疆阜康市職業中等專業學校，新疆 阜康 831500)

蛹蟲草(CordycepsmilitarisLink)隸屬于蟲草科(Cordyycepscipitaceae)蟲草屬(Cordyceps)，蟲草素、蟲草酸、多糖、SOD酶等是蟲草類真菌中主要活性物質[1～3]，具有提高免疫力、抑制腫瘤等多種功效[4～6]。但野生冬蟲夏草產量較低，價格高達每千克二十余萬元，資源也日趨減少，致使其價格不斷上漲。而蛹蟲草為人工培養，栽培技術日益成熟，已實現產業化生產，價格僅為100元·kg-1。但是由于菌種退化和人工培養環境影響因素較多，產量和品質仍是目前蛹蟲草生產需要解決的問題。四甲基戊二酸可通過調節生物體內蛋白質代謝，加快生物體生長，達到增產，改善品質的作用。筆者探討了四甲基戊二酸對菌絲和子座生長的影響規律，建立相應的數學模型，探究其對蛹蟲草生長的影響機理，確定最適添加量，為工廠化生產中提高蛹蟲草產量和品質提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 供試菌種由西北農林科技大學提供，菌株編號為CM-16。

1.1.2 培養基 主要有:

母種培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，蔗糖10 g，蛋白胨3 g，瓊脂粉12 g，水1 000 mL(pH6.5～7.0)。

原種培養基：葡萄糖10 g，蔗糖10g，蛋白胨5 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，檸檬酸鐵胺0.5 g，水1 000 mL(pH7.0)。

栽培原料：小麥。

栽培容器為：300 mm×200 mm×110 mm專用塑料盒。

1.1.3 植物生長調節劑 四甲基戊二酸(TGA)

1.2 方法

1.2.1 菌種制備 將蛹蟲草母種活化2次，轉接到母種平板培養基，菌絲體長滿后即為一級菌種。

將一級菌種定量轉接原種培養基，置于24℃、190 r/min震蕩培養箱培養5d，再定量轉接至原種液體培養基，按上述條件培養3d即為栽培用的液體菌種。

1.2.2 四甲基戊二酸對菌絲生長的作用 將TGA添加在母種培養基中制備得到試驗用平板培養基，使其濃度分別為0，0.01，0.1，1，5，10和15 mg·L-1，各濃度水平重復5次。將直徑為9 mm的“菌餅”接種在平板培養基上，培養條件溫度約18℃、空氣濕度約65%，每隔3 d測量標記并測量菌落直徑[7]。

1.2.3 四甲基戊二酸對子座生長發育的影響 TGA試驗水平：分別為0，1，2，3，4和5 mg·L-1，其添加量以蛹蟲草栽培用水量(每盒450 mL)計算。

方法：按照常規熟料方法栽培，每盒添加風干小麥300 g，不同濃度四甲基戊二酸水溶液450 mL，于121℃滅菌60 min，冷卻到25℃以下接種，每盒接種量40 mL。將接種后的栽培盒于溫度18～21℃、空氣相對濕度80%～90%、CO2體積分數小于0.2%～0.3%的條件下黑暗培養6 d，從第7天開始每天光照8 h，光照強度400 lx，所有栽培盒均隨機擺放，定期調換擺放位置。

測定指標：當盒內90%左右的子座頂部膨大時采收，測定子座長度、直徑、密度、鮮質量，計算生產周期、基質利用率等指標。

基質利用率=[(初始基質風干質量-剩余基質風干質量)/初始基質風干質量]×100%。

1.2.4 數據處理 采用SPSS和EXCEL圖表進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 四甲基戊二酸對菌絲生長速率的影響

由圖1可見，當TGA濃度為0～0.1 mg·L-1時，對菌絲生長速率的影響不大；當TGA濃度為0.1～15 mg·L-1時，菌絲生長呈現先升后降趨勢，當濃度為5 mg·L-1時菌絲生長最快，達到3.88 mm·d-1。表明不同濃度TGA對菌絲生長呈現出低促高抑的作用。

2.2 四甲基戊二酸對子座生長發育的影響

2.2.1 四甲基戊二酸濃度對子座分化時間的影響 由圖2可見，TGA能促進子座提前分化，不同濃度對子座分化時間影響不同；TGA濃度為1.0 mg·L-1時，子座形成最早，比對照提前1.6 d。隨著濃度增高，分化時間逐漸延長，濃度為5 mg·L-1時子座形成最晚。

經計算可得蛹蟲草子座分化時間(Y2)與TGA濃度(X2)之間的函數關系：

Y2=16.9816-1.5940/X2

(1)

對方程(1)進行方差分析可得：F回歸=29.09>F0.01(1,4)=21.2，P=0.0057<0.01，表明該方程達到極顯著水平，此模型成立。

對方程(1)求極值得：

X(2)max=1.0(mg·L-1

Y(2)max=15.4(d)

即TGA濃度為1.0 mg·L-1時，蛹蟲草子座分化的最早為15.4 d。

2.2.2 四甲基戊二酸濃度對子座長度的影響 由圖3可見，隨著TGA添加濃度的提高，子座的長度迅速增加，過量的添加不利于子座的伸長

經計算可得子座長度(Y3)與TGA濃度(X3)之間的函數關系：

Y3=-0.502X34+6.298X33+27.162X32+43.935X3+59.53

(3)

對方程(2)進行方差分析可得：P=0.0395<0.05，表明該方程達到顯著水平。

對方程(2)求極值得：

X(3)max=1.35(mg·L-1)

Y(3)max=83.2(mm)

即TGA濃度為1.35 mg·L-1時，子座長度為83.2mm，達到最長。

2.2.3 四甲基戊二酸濃度對子座直徑的影響 經計算得子座直徑(Y4)與TGA濃度(X4)的函數關系：

Y4=3.4757+0.878349/X4

(3)

對(3)式方差分析得：F回歸=20.077>F0.05(1,4)= 7.71，P=0.011<0.05，表明該方程達到顯著水平。

對方程(3)求極值得：

X(4)max=1.0(mg·L-1)

Y(4)max=4.35(mm)

即TGA濃度為1.0 mg·L-1時，子座直徑最大為4.35 mm。

由圖4可見， TGA濃度增加至1.0 mg·L-1時，子座直徑急劇增大，達到最高為4.35 mm；當濃度大于1.0 mg·L-1，隨濃度升高子座直徑迅速減小，濃度在5 mg·L-1時子座最細；低濃度TGA能夠刺激子座橫向生長，而高濃度會抑制生長，使子座直徑纖細。

2.2.4 四甲基戊二酸濃度對子座密度的影響 由圖5可見,隨著TGA濃度的增加，子座密度雖先減小后增大，但整體變化不大。表明TGA對單位面積子座數量的影響不顯著。對4/5值進行校正。原因是子座直徑增加后，密度必然減少。

2.2.5 四甲基戊二酸濃度對子座鮮質量的影響 圖6經計算可得子座鮮質量(Y6)與TGA濃度(X6)之間的函數關系為：

y = 0.927x3- 10.31x2+ 24.28x + 231

(4)

對方程(4)進行方差分析可得：F回歸=17.319>F0.05(2,3)=9.55，P=0.0551<0.05，表明該方程達到顯著水平，此模型成立。

對方程(4)求極值得：

X(4)max=1.47 (mg·L-1)

Y(4)max=247.35(g·盒-1)

即TGA濃度為1.47 mg·L-1時，蛹蟲草產量最高為每盒247.35 g。

從圖6可見，當四甲基戊二酸濃度增加至1.47 mg·L-1時，子座鮮質量迅速增加，達到最高為247.35 g·盒-1。當濃度高于1.47 mg·L-1時，子座鮮質量隨濃度的增加迅速降低，5 mg·L-1時降至最低，且低于對照組。

2.2.6 四甲基戊二酸濃度對生產周期的影響 由圖7經計算可得生產周期(Y7)與TGA濃度(X7)之間的函數關系為：

Y7=-0.1306X73+1.1685X72-2.4593X7+47.612

(5)

對方程(5)進行方差分析可得：F回歸=29.03>F0.05(2,3)=9.55，P=0.0335<0.05，表明該方程達到顯著水平，此模型成立。

對方程(5)求極值得：X(7)max=1.45(mg·L-1)，Y(7)max=46.1(d)

即TGA濃度為1.45 mg·L-1時，蛹蟲生產周期最短為46.1d。

由圖7可見，TGA濃度為1.45 mg·L-1時，生產周期最短為46.1 d，比對照縮短1.5 d。隨著添加濃度的繼續升高，生產周期逐漸延長。表明低濃度的TGA有利于子座發育成熟，提前采收期。

2.2.7 四甲基戊二酸濃度對基質利用率的影響 由圖8經計算可得基質利用率(Y8)與TGA濃度(X8)之間的函數關系為：

Y8=X8/(-0.292436+0.434463X8)+35.3025

(6)

對方程(6)進行方差分析可得：F回歸=40.5889>F0.01(2,3)= 30.81，P=0.0067<0.01，表明該方程達到極顯著水平，此模型成立。

對方程(6)求極值得：X(8)max=1.0(mg·L-1)Y(8)max=42(%)

即TGA濃度為1.0 mg·L-1時，蛹蟲草對基質的利用最充分為42%。

由圖8可見，試驗范圍內基質利用率均高于對照組。表明TGA能夠加快蛹蟲草對基質營養的吸收利用；當TGA濃度增加至1 mg·L-1時，基質利用率迅速上升至最高為42%。這一濃度下子座鮮質量也達到最高，表明此濃度下可以加快子座對基質營養的吸收利用，提高子座產量。隨著濃度的繼續增加，蛹蟲草對基質營養的吸收利用逐漸減弱。

3 結論與討論

3.1 四甲基戊二酸能夠促進蛹蟲草菌絲生長

培養基中添加適量的四甲基戊二酸能夠起到增強細胞活力，刺激菌絲生長部位的敏感性，加快生長速率的作用，以5 mg·L-1濃度下促生長作用顯著高于其它濃度。濃度過低時對其它內源激素的刺激作用弱，達不到顯著促生長作用，濃度過高時則會打破激素間的平衡，無法正常生長。

3.2 四甲基戊二酸能夠促進蛹蟲草子座生長發育

不同濃度的四甲基戊二酸對蛹蟲草營養生長和生殖生長階段均有促進作用。添加濃度在1～2 mg·L-1范圍時，四甲基戊二酸能夠作用于細胞，充當內源激素的作用，提高菌絲生長部位的敏感性，使菌絲生長加快，原基分化提早完成，子座采收提前。低濃度作用下細胞活力旺盛，生長代謝加快，對基質營養吸收轉化更加充分，產量明顯提高。而高濃度對生長發育的促進作用明顯減弱，甚至產生了抑制作用。

四甲基戊二酸能夠通過參與生物體內的多種主要代謝過程，來實現改良品質和增產的目的。固體栽培過程中子座長度、直徑、產量和基質利用均呈現正相關，表明四甲基戊二酸低濃度作用下能夠使蛹蟲草細胞快速分裂、變大，子座粗壯。同時低濃度下能夠快速滲入細胞，提高細胞內原生質的流動，增強細胞活力，抗逆性增加，基質中碳源和氮源等營養吸收更充分，提高了基質的利用率，使生物量增加，產量提高。戊二酸濃度超出適宜的范圍后，破壞了蛹蟲草內源激素間的平衡作用，且過高的濃度使細胞滲透壓加大，不利于原生質的流動，細胞生長受到抑制，各項指標均有所下降。

綜上所述，生產中可添加四甲基戊二酸濃度在1～2 mg·L-1范圍內以提高蛹蟲草產量。以添加濃度為1.0 mg·L-1時蛹蟲草生長發育狀況為最佳。子座分化時間為15.4 d；子座長度83.2 mm；直徑達到4.35 mm；生產周期最短為46 d；基質利用率為42%。