鴿皰疹病毒XY2019株的分離鑒定與UL30基因序列分析

吳旭錦，朱小甫，熊忙利，張文娟，尚紅梅，楊 萍

(1.咸陽職業技術學院 畜牧獸醫研究所，咸陽市動物疫病分子生物學診斷技術研究重點實驗室，陜西 咸陽 712000；2.咸陽市動物疫病預防控制中心，陜西 咸陽 712000)

鴿皰疹病毒(Pigeonherpesvirus,PiHV)在分類上屬于皰疹病毒科，但目前為止尚未歸入亞科和屬[1]。鴿子是PiHV的自然宿主，有報道長尾小鸚鵡能夠感染，雞、鴨、金絲雀對PiHV有抵抗力[2]。鴿自然感染表現為精神萎靡，采食下降，以結膜炎和鼻炎為特征，對鴿群健康危害較大，PiHV感染導致鴿群死淘增加，帶來了一定的經濟損失[3]。近年來，我國肉鴿消費量急劇上漲，賽鴿競翔活動參與越來越廣泛，鴿子的飼養量迅速增長[4～7]。但長期以來，學界對鴿皰疹病毒感染研究資料缺乏，對該病的病原基因特征、診斷方法、防控措施等方面研究薄弱[8]。本課題組從臨床發病鴿群中分離到1株PiHV，進行了基因特征分析，以期為臨床防控PiHV感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 組織病料主要包括肝臟、脾臟、腎臟及肺臟，采集自陜西省咸陽市某賽鴿愛好者飼養的鴿群疑似PiHV感染病例。

1.1.2 SPF雞胚 SPF雞蛋，北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司生產，本課題組自行孵化雞胚，用于病毒分離。

1.1.3 試劑 DNAiso、RNAiso、rTaq酶、dNTP等分子生物學試劑，購自大連寶生物；pGEM-T easy載體克隆試劑盒，購自Promega公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，購自上海生工；DH5ɑ大腸埃希菌由咸陽市動物疫病分子生物學診斷技術研究重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank公開的PiHV基因序列KX589235/NC034266，針對UL30基因設計了1對引物，UL30-F：5’-GCTGTGTTTCGATATCGAGTGC-3’， UL30-R：5’-TCCAGCAAGACGGCCTGATC-3’，預期擴增片段1 326 bp。引物由上海生工合成，用DEPC處理水稀釋到20 μmol·L-1工作濃度，用于PiHV UL30基因序列擴增分析。

1.2.2 病例觀察 2019年4月，陜西省咸陽市某賽鴿愛好者飼養的賽鴿發病，課題組進行了臨床診斷并進行了病理解剖，無菌操作采集組織病料備用。

1.2.3 病料處理與常見病原檢測 將采集的組織樣品加約5倍體積滅菌生理鹽水剪碎，研磨呈糊狀，10 000 g離心10 min，取上清液-70 ℃保存備用。采用課題組建立的新城疫、H9禽流感、傳染性喉氣管炎、傳染性鼻炎PCR /RT-PCR檢測方法進行檢測，排查常見呼吸道病原感染情況。

1.2.4 病毒分離 給處理好的組織病料上清液加入雙抗，至終濃度含青霉素、鏈霉素各2 mg·mL-1，室溫靜置30 min。選擇9日齡SPF雞胚，尿囊腔途徑接種上清液0.2 mL，恒溫恒濕培養箱中繼續孵化，每8 h照胚一次。24 h內死胚棄去，收獲死亡雞胚的尿囊液、絨毛尿囊膜，孵化4 d后仍未死亡雞胚凍死后收獲。研磨收獲的絨毛尿囊膜，10 000 g離心5 min，收上清液。按照上述方法連續傳代直至雞胚出現規律性死亡。

1.2.5 傳代病毒UL30基因PCR擴增 按照DNAiso試劑說明提取DNA。PCR擴增體系：DNA溶液 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，UL30-F、UL30-R各0.5 μL，rTaq酶0.5μL，超純水補足至總體積25.0 μL。PCR程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，循環35次；最后72 ℃延伸7 min。取5.0 μL產物電泳后成像系統中觀察。

1.2.6UL30基因克隆測序與分析 按照UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒說明將獲得的DNA片段純化，連接pGEM-T easy載體，轉化感受態細胞，培養后挑取單個菌落，37℃搖動培養12 h，PCR鑒定陽性后提取質粒，酶切鑒定后測序，將獲得序列和參考序列比對分析。

2 結果與分析

2.1 病鴿臨床癥狀、剖檢變化以及常見病毒檢測

病鴿咳嗽、甩鼻，鼻孔有黏液，結膜潮紅。剖檢發現，鴿子口腔有大小不一的黃色干酪團塊附著；肺臟充血；肝腫，被膜緊張，表面有白色壞死區域；胰腺稍腫、潮紅。其他臟器無肉眼可見變化。NDV、AIV H9、ILTV、副雞嗜血桿菌PCR /RT-PCR檢測均為陰性。

2.2 病毒分離結果

尿囊腔接種連續傳代至第3代后，雞胚接種48-72h集中死亡。剖檢可見胚體皮膚有點狀出血，肝臟腫脹，邊緣鈍圓，被膜緊張，顏色發黃并有壞死區或壞死點。

2.3 傳代病毒UL30基因PCR擴增結果

對收獲的尿囊液、絨毛尿囊膜進行病毒PCR擴增，電泳結果表明從樣本中成功擴增出了1326bp的目的條帶(圖1)，證實病毒分離成功，命名為XY2019株。

2.4 UL30基因測序與分析結果

回收UL30基因片段，連接pGEM-T easy載體，構建質粒并酶切鑒定，結果顯示酶切片段大小符合預期結果(圖2)。

鑒定正確的陽性質粒測序后成功獲得了XY2019株1 326 bp長度的UL30基因片段，利用DNAStar軟件，將獲得序列與GenBank中已知參考序列比對，同源性結果見圖3，系統發生樹見圖4。

GenBank中PiHVUL30基因參考序列僅有4株，參考序列BJ株分離于中國北京市，登錄號KC544263，來源于鴿；HLJ株分離于中國黑龍江省，登錄號KX589235，來源于野鴿；S-18株分離于墨西哥，登錄號NC024450，來源于獵鷹；登錄號AF141890無毒株名，分離于德國，來源動物未提供。圖3中，XY2019株UL30基因與這4株參考序列同源性在99.9%～100%之間。圖4顯示，比對序列形成2個大分支，XY2019、HLJ、S-18、BJ株處在一個分支上，而AF141890單獨在一個分支上。

3 討論

PiHV是一種鴿群重要的病原，最早于1936年在獵鷹體內分離成功[9]，但迄今學界對其研究仍極為有限。趙盼盼[10]分離了野鴿皰疹病毒HLJ株，并克隆了UL27基因，進行了序列變異分析。薛媚等[11]參考GenBank公開的PiHV基因信息，設計檢測引物，優化了PCR反應條件，建成了一種PiHV PCR診斷方法，并進行了臨床應用診斷。筆者研究首先通過PCR/RT-PCR方法排除了新城疫、H9禽流感、傳染性喉氣管炎、傳染性鼻炎等有呼吸道癥狀傳染病感染的可能性，然后利用PiHV能感染9-11日齡雞胚的特點，通過SPF雞胚連續3次傳代，成功從賽鴿病料中分離到了PiHV野毒株XY2019株。通過PCR技術成功擴增了XY2019株UL30基因1 326 bp片段，序列比對分析表明，該毒株與和參考序列高度同源，這4株參考毒株分離時間、地域跨度很大，提示無論是來源于不同動物種類、不同分離國家或地區的PiHV UL30基因均高度保守，遺傳性高度穩定。基因進化樹顯示，參比毒株形成2個大分支，XY2019、HLJ、S-18、BJ株處在一個分支上，而AF141890單獨在一個分支上，表明該毒株遺傳進化上與其他毒株存在一定差異。由于對PiHV基因序列研究尚不充分，公開的基因序列過少，尚不能構建精細的進化圖譜。筆者研究分離成功XY2019株，為進一步研究毒株全基因序列、開發快速診斷方法、疫苗研究奠定了物質基礎。