人工紅細(xì)胞膜泡的合成及其體外遞送阿霉素的可行性

姜津 羅婷婷 潘煒倫 馮俊杰 鄭皖程 李博

1廣州血液中心（廣州510000）；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗科（廣州510515）；3南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（廣州510515）

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是一種細(xì)胞膜來源的具有磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)的囊泡，可攜帶重要信息物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及小分子等進(jìn)行細(xì)胞間通訊［1］。由于EV 可穩(wěn)定存在于體液循環(huán)中，使得其成為具有天然優(yōu)勢的藥物遞送平臺。目前，EV 已被成功用于化學(xué)藥物、RNA 藥物及納米材料遞送系統(tǒng)的構(gòu)建［2］。但是，由于缺乏高效的純化和載藥方法，EV 作為藥物遞送平臺的應(yīng)用受到明顯限制。故需構(gòu)建可高效純化與載藥的人工合成脂質(zhì)體、細(xì)胞膜泡等EV 類似物用于藥物遞送研究［3］。紅細(xì)胞（red blood cells，RBC）膜同為磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，是人工合成EV類似物的重要原料之一。與EV 相比，RBC 更容易從人體中獲得，幾十年來一直安全、常規(guī)地用于輸血治療。且RBC 是體內(nèi)含量最豐富的細(xì)胞類型（約占細(xì)胞總數(shù)的84%），胞內(nèi)不含細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞器［4］，因此紅細(xì)胞膜可大規(guī)模獲取并高效提取純化。在此基礎(chǔ)上制備的人工紅細(xì)胞膜泡（artificial red blood cells membrane vesicle，ARBCMV）可作為遞送載體裝載不同的成像或治療材料，應(yīng)用于疾病的診斷和治療。最近，通過低滲裂解與物理擠出方法制備的ARBCMV 成功包封聲動力治療納米顆粒，并在動物體內(nèi)實驗中證實其增強(qiáng)腫瘤造影引導(dǎo)的聲動力治療效果，但其直接裝載化學(xué)藥物的能力尚未得到證實［5-6］。阿霉素是一種常用的蒽環(huán)類抗腫瘤化療藥物，抗瘤譜較廣，且具有優(yōu)良的熒光特性和光學(xué)穩(wěn)定性。但其毒性反應(yīng)大，長期單獨使用可造成不可逆的心臟毒性、骨髓抑制等副反應(yīng)，同時其體內(nèi)循環(huán)時間短，難以達(dá)到深層組織腫瘤病灶，構(gòu)建穩(wěn)定且安全的載藥系統(tǒng)能提高其利用效率并減輕毒副作用［7-9］。因此，有必要探索ARBCMV 負(fù)載并遞送藥物的可行性，從而進(jìn)一步拓展ARBCMV 在藥物遞送領(lǐng)域的應(yīng)用。本研究選用低滲裂解與物理擠出方法制備ARBCMV，以人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞來源EV為對照，首次通過實驗研究比較兩者形態(tài)、粒徑分布及合成效率，在細(xì)胞水平驗證其與人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的融合，并創(chuàng)新性探索載阿霉素ARBCMV 的載藥量及遞送阿霉素進(jìn)入人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的能力，為構(gòu)建穩(wěn)定并安全的阿霉素載藥系統(tǒng)打下實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料RBC 取自廣州血液中心高轉(zhuǎn)氨酶報廢血，為經(jīng)過白細(xì)胞濾器的去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞（400 mL 血袋裝，A 型血，2～6 ℃體外保存35 d以內(nèi)），人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 細(xì)胞系購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS 1×，pH 7.4，Gibco，500 mL/瓶，C10010500BT-1）、DMEM 培養(yǎng)液（Gibco，500 mL/瓶，C11995500BT-1）、胰酶消化液（Gibco，500 mL/瓶，25200-072）、青霉素-鏈霉素溶液（Gibco，100 mL/瓶，15140122）、胎牛血清（Gibco，50 mL/瓶，A8160802）、去外泌體胎牛血清（Biolog Ical，50 mL/瓶，C38010050-1）、鹽酸-阿霉素（Aladdin，D107159-25 mg）、150 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿（Nest，715001）、六孔培養(yǎng)板（Sorfa，220100）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Solarbio，25 g/瓶，A8020-25）、Hoechst 33342 活細(xì)胞染色液（Solarbio，50 mL/瓶，C0030-50）、0.22 μm 濾器（Merck millipore，250 個/箱，SLGP033RB）、0.5 mL 超濾管（Merck millipore，100 K，UFC510096-1）、親脂性染料PKH-67（Sigma，1KT，MINI67-1KT）、0.4 μm 聚碳酸酯膜19 mm（Whatman，800282），0.2 μm 聚碳酸酯膜19 mm（Whatman，800281）

1.2 儀器Avanti 擠出器（上海默格機(jī)械有限公司）、ZetaView 納米顆粒追蹤分析儀（英國Malvern公司）、L-80XP 超高速離心機(jī)（美國Beckman Coulter 公司），3H16RI 高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），H-7650 透射電子顯微鏡（日本HITACHI 公司），SCIENTZSB-5200 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），CKX41 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）、LS-55 熒光分光光度計（美國Perkin-Elmer 公司）。

1.3 方法

1.3.1 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞來源EV的制備細(xì)胞培養(yǎng)：在含有10% 胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞，待其生長密度為60%～70%時，用PBS 洗滌細(xì)胞，加入不含胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12 h。細(xì)胞饑餓處理后再次用PBS 洗滌，加入含有1%去外泌體血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞上清液并隨機(jī)選擇3 皿細(xì)胞用牛鮑計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

細(xì)胞上清前處理：300 g 離心10 min，2 000 g 離心20 min，10 000 g 離心30 min，離心后均取上清液，最后收集上清液共450 mL。

超速離心法提取外泌體：在離心管中加入36.8 mL 前處理后的細(xì)胞上清液，在135 000 g 的條件下4 ℃離心70 min，棄去上清液。再加入36.8 mL前處理后的上清液重懸管底沉淀，以同樣條件離心后棄去上清液，用200 μL PBS 重懸沉淀后放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 制備ARBCMV洗滌RBC：對RBC 進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，取與MDA-MB-231 細(xì)胞數(shù)相同的RBC 進(jìn)行低滲裂解［5］：吸取4.6 μL RBC 稀釋至200 μL 冷PBS 中，用高速冷凍離心機(jī)4 ℃800 g 離心5 min，棄去上清液，重復(fù)3 次。

提取RBC 膜：往洗滌后的RBC 加入200 μL 0.25×冷PBS，放置于冰上低滲裂解紅細(xì)胞20 min，在4 ℃10 000 g條件下離心5 min，棄去上清液，重復(fù)2 次。加入200 μL 純水重懸沉淀，在4 ℃10 000 g條件下離心5 min，棄去上清液，所得沉淀用PBS 洗滌1 次，最后用1 mL PBS 重懸細(xì)胞膜，超聲5 min，得到破碎的紅細(xì)胞膜。

ARBCMV 均一化處理：將所提取的紅細(xì)胞膜用孔徑為400 nm 的聚碳酯纖維膜反復(fù)擠壓5 次，再用孔徑為200 nm 的聚碳酯纖維膜擠壓15 次，得到納米級ARBCMV，保存于4 ℃?zhèn)溆谩Ｒ妶D1。

圖1 ARBCMV 制備過程Fig.1 Synthesis procedure of ARBCMV

1.3.3 載阿霉素的ARBCMV 制備將阿霉素PBS溶液加入紅細(xì)胞膜提取液中，用400 nm 聚碳酯纖維膜擠壓5 次，再經(jīng)200 nm 的聚碳酯纖維膜擠壓15 次，在4 ℃19 000 g 條件下離心30 min，洗滌沉淀2 次。最后加入PBS 重懸沉淀，得到裝載阿霉素的ARBCMV。

1.3.4 ARBCMV 和EV 的比較用透射電子顯微鏡對ARBCMV 和EV 進(jìn)行觀察，比較兩者的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。用ZetaView 納米顆粒追蹤分析儀對稀釋后1 mL ARBCMV 和EV 溶液的顆粒數(shù)和粒徑分布進(jìn)行表征，在此基礎(chǔ)上對ARBCMV 和EV 分離時間和提取量進(jìn)行比較，采用兩獨立樣本t檢驗對兩樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.5 ARBCMV 與人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的融合取1 010 個ARBCMV 稀釋至250 μL PBS中，加入親脂性染料PKH-67 對其進(jìn)行染色5 min，以PBS 為空白對照。再加入500 μL 1% BSA PBS溶液吸附游離染料，用100 KD 超濾管13 900 g 離心10 min，重復(fù)洗滌3 次除去多余染料。將MDAMB-231 細(xì)胞鋪在6 孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，PBS 洗滌2 次，加 入1 mL 培養(yǎng)液及1 mL PKH-67 標(biāo)記后的ARBCMV，避光孵育6 h。用PBS 洗滌細(xì)胞2 次除去游離ARBCMV 后加入Hoechst 33342 活細(xì)胞染料反應(yīng)15 min，PBS 洗滌兩次后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.6 載阿霉素ARBCMV的載藥量分析配制梯度的PBS 阿 霉素溶液：0、0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.22、0.26、0.30、0.34、0.50、0.76、1.00 μg/50 μL。分別測量其在488 nm 激發(fā)光下，590 nm 處的吸收峰值，根據(jù)熒光值繪制阿霉素?zé)晒鈽?biāo)準(zhǔn)曲線。測量載阿霉素ARBCMV 離心后上清液的熒光值，以及加入的阿霉素的熒光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得阿霉素量。ARBCMV 載阿霉素量=載藥前阿霉素量-載藥后上清液中阿霉素量。

1.3.7 ARBCMV 遞送阿霉素進(jìn)入人乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞的驗證將MDA-MB-231 細(xì)胞鋪在6 孔板上培養(yǎng)24 h，PBS 洗滌2 次，加入顆粒數(shù)為1 010 的載阿霉素ARBCMV 和1 mL 培養(yǎng)液，避光孵育6 h。用PBS 洗滌細(xì)胞2 次除去游離ARBCMV后加入Hoechst 33342 活細(xì)胞染料反應(yīng)15 min，PBS洗滌2 遍后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARBCMV 和EV 的形態(tài)與粒徑見圖2。透射電子顯微鏡下，ARBCMV 和MDA-MB-231 EV 均為具有完整的膜性脂質(zhì)雙分子層的杯狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)為進(jìn)一步裝載藥物提供空間，直徑均為100～200 nm，與文獻(xiàn)報道相符［10］。ZetaView 納米顆粒追蹤分析儀檢測ARBCMV 和MDA-MB-231 EV 的顆粒數(shù)和粒徑分布結(jié)果，制備出的ARBCMV 粒徑峰值為（133.7 ± 5.4）nm，與TEM 的結(jié)果相符，濃度為（3.1±1.2）×1010/mL，從細(xì)胞上清液中提取的MDAMB-231 EV 粒徑峰值為（160.5 ± 4.2）nm，濃度為（10.2 ± 2.4）×1010/mL。結(jié)果證實人工制備而來的ARBCMV 粒徑相對更均一。

2.2 ARBCMV 和EV 分離時間和提取量比較見表1。ARBCMV 和EV 的分離時間和提取量比較可知，提取EV 需預(yù)先成功培養(yǎng)細(xì)胞，并超高速離心4 h，操作繁瑣且耗時達(dá)2～3 d，而ARBCMV 制備僅需普通冷凍高速離心機(jī)和擠出器即可完成實驗，時長大約100 min。等量細(xì)胞可提取的MDAMB-231 EV 平均數(shù)量為2.04 × 1010個，ARBCMV 平均數(shù)量為3.10 × 1010個，結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因此，在相同的細(xì)胞數(shù)量情況下，可以提取相近的囊泡數(shù)量，但制備ARBCMV 無需培養(yǎng)細(xì)胞，更加快速且高效，不依賴超高速離心機(jī)，對實驗室設(shè)備要求較低，因此更易于推廣應(yīng)用。

圖2 透射電子顯微鏡圖Fig.2 TEM images of ARBCMV

表1 MDA-MB-231 EV 與ARBCMV 分離時間與提取量比較Tab.1 Comparison of isolation time and yield between ARBCMV and MDA-MB-231 EV

2.3 ARBCMV 與人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的融合見圖3。ARBCMV 經(jīng)過PKH-67 膜染料染色后與細(xì)胞共孵育可使人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的細(xì)胞膜帶熒光，說明ARBCMV 與人乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞成功融合，具有作為藥物載體并作用于癌細(xì)胞的潛力。

圖3 ARBCMV 與人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞的融合熒光圖（400×）Fig.3 Fluorescent images of breast cancer cells MDA-MB-231 fused with ARBCMV（400×）

2.4 載阿霉素ARBCMV 的載藥量分析通過阿霉素濃度梯度與熒光值檢測繪制阿霉素?zé)晒鈽?biāo)準(zhǔn)曲線。見圖4，熒光強(qiáng)度與阿霉素量相關(guān)性的回歸方程為y=282.230x+4.317，R2= 0.993。載藥前，取1 μL 阿霉素PBS 稀釋20 倍并測量熒光強(qiáng)度為29.000，代入公式得x=0.087 5，即加入紅細(xì)胞膜懸液中的1 μL 阿霉素量為1.749 μg。同理取擠出后離心所得上清液1 μL 稀釋20 倍后測得平均熒光強(qiáng)度為22.639，代入公式得x=0.064 9，即1 μL 上清液中阿霉素量為1.298 μg。因此，每mL ARBCMV阿霉素載入量為0.451 μg，說明ARBCMV 能負(fù)載阿霉素，具有載藥的能力。

2.5 ARBCMV 遞送阿霉素進(jìn)入人乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞的驗證由于阿霉素在488 nm 激發(fā)光照射下發(fā)射紅色熒光，載阿霉素ARBCMV與人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞共孵育后熒光圖見圖5。紅光熒光的阿霉素成功進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可以通過這種方式達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。同時結(jié)合圖3，證明ARBCMV 能夠通過與細(xì)胞膜融合遞送阿霉素進(jìn)入人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中，具有作為藥物遞送載體的能力。

圖4 阿霉素?zé)晒鈽?biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of fluorescence intensity of doxorubicin

3 討論

圖5 ARBCMV 遞送阿霉素進(jìn)入人乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞熒光圖（400×）Fig.5 Fluorescent images of breast cancer cells MDA-MB-231 treated with doxorubicin loaded ARBCMV（400×）

紅細(xì)胞在人體血液循環(huán)內(nèi)分布廣泛，取材簡單方便。本研究在高效提取純化紅細(xì)胞膜的基礎(chǔ)上制備的ARBCMV，具有與EV 類似的膜性脂質(zhì)雙分子層環(huán)狀結(jié)構(gòu)，粒徑峰值大小為（133.7±5.4）nm，合成效率高且不依賴超高速離心設(shè)備，具有負(fù)載阿霉素的能力。并在體外實驗中證實其負(fù)載并遞送阿霉素進(jìn)入乳腺癌細(xì)胞的可行性。由于ARBCMV具有流動性的磷脂雙分子層，其可直接與靶細(xì)胞膜融合，從而提高被包封藥物的細(xì)胞內(nèi)化效率，可有效增強(qiáng)治療效果。ARBCMV 作為藥物遞送平臺的優(yōu)勢如下［11］：（1）具有免疫逃避功能，體內(nèi)循環(huán)時間長；（2）天然的生物相容性和可降解性；（3）避免納米制劑固有的毒性；（4）可大規(guī)模制備，造價低廉。根據(jù)文獻(xiàn)報道，ARBCMV 包裹的載阿霉素和紫杉醇納米粒子在體外實驗中的腫瘤生長抑制效果大約是紫杉醇和阿霉素的6 倍［12］；此外，ARBCMV 包裹的長春新堿脂質(zhì)體在膠質(zhì)瘤小鼠模型體內(nèi)試驗中顯示出更長的循環(huán)時間和更顯著的療效，與商品化藥物相比，ARBCMV仿生納米顆粒可顯著提高小鼠的存活率［13］。因此，ARBCMV有望成為極具潛力的載藥遞送平臺應(yīng)用于腫瘤診療。

然而，由于ARBCMV 的膜結(jié)構(gòu)來源于紅細(xì)胞膜，作為藥物遞送平臺缺乏治療靶向性。因此，可以借鑒EV 工程化的方法，對ARBCMV 進(jìn)行修飾和編輯，以期獲得更精準(zhǔn)的腫瘤治療效果。例如，有研究在載阿霉素的EV 表面修飾iRGD 肽段，靶向腫瘤細(xì)胞特異性高表達(dá)的αv 整合素，增加其腫瘤靶向性，進(jìn)而有效減小荷瘤小鼠的腫瘤體積［14］。同時，cRGD 環(huán)肽可靶向結(jié)合αvβ3 整合素，也具有靶向惡性腫瘤細(xì)胞的作用［15］。前期研究證實cRGD 修飾在納米顆粒表面可增加載藥納米顆粒的腫瘤靶向性［16-17］，因此理論上cRGD 修飾的載藥ARBCMV 也具有腫瘤靶向性潛力，其治療效果及體內(nèi)組織分布有待動物模型實驗進(jìn)一步證實［18］。此外，目前也有研究通過雜化各種囊泡膜結(jié)構(gòu)豐富納米膜泡功能，如紅細(xì)胞膜與癌細(xì)胞膜的雜化膜包裹抗腫瘤藥物［19］，可將免疫逃避的作用與特定腫瘤靶向作用互補(bǔ)，同時發(fā)揮紅細(xì)胞膜與其它功能化膜的優(yōu)勢，用于腫瘤細(xì)胞靶向治療和腫瘤穿透治療的研究；功能化脂質(zhì)體與EV 融合增加EV 功能并保存其內(nèi)在含量和生物特性［20］，提高化療藥物的細(xì)胞傳遞效率等。以上研究均為ARBCMV 功能化修飾，進(jìn)而為提高腫瘤靶向治療效率并降低靶外副作用提供借鑒和理論依據(jù)。

綜上所述，本研究構(gòu)建了ARBCMV 高效制備平臺，合成負(fù)載阿霉素的ARBCMV，證實其在體外遞送阿霉素進(jìn)入乳腺癌細(xì)胞的可行性，為進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用新型ARBCMV 藥物遞送系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤精準(zhǔn)診療打下實驗和理論基礎(chǔ)。