Fibulin-3在腹主動脈瘤中的表達

喻嬋 王卓 李穩磊 張熾明 朱瑤瑤 任建聰 林忠偉

1廣東藥科大學附屬第一醫院心內科（廣州510080）；2中山大學附屬第一醫院病理科（廣州510080）；3中國醫科大學附屬第一醫院血管及甲狀腺外科（沈陽110000）

據2018年中國心血管病報告顯示，我國心血管病的發病人數仍在持續增加，并處于快速增長水平［1］。腹主動脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是一種在人群發病率近5%的退行性心血管疾病［2-3］。據統計AAA 病死率高達50%～70%，而破裂性AAA 的病死率已經高達80%～95%［4-5］。臨床目前普遍認為腹主動脈瘤體直徑≥5 cm 時有外科手術指征［6］，但近年臨床研究顯示單純根據瘤體直徑并不能確切預測AAA 破裂風險。因此，AAA 的預防與治療、疾病產生及演變的機制成為研究重點，而如何控制其發展變化，減少不必要的手術尤為必要。

Fibulin-3 是一種細胞外基質蛋白［7］，廣泛表達于包括脈管系統［7-8］在內的各種組織中。Fibulin-3參與基底膜的組織和彈性纖維的形成［9］，同時與其他基質蛋白相互作用，形成錨定結構以調節細胞增殖和遷移［10］。此外，Fibulin-3 促進血管生成［11］并參與各種細胞內信號傳導途徑［12-13］。Fibulin-3以前被認為是動脈生長因子［11］，注射Fibulin-3 蛋白會增加自發性高血壓大鼠的主動脈壁厚度，其功能與對基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）的調節有關［14-15］。動脈壁的破壞是AAA 的關鍵機制之一，Fibulin-3 在AAA 患者中的表達情況未有研究深入探討。因此本研究的目的是探索及驗證AAA 患者中是否存在Fibulin-3 基因的表達異常，初步分析其在AAA 中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料收取2017年9月至2019年11月廣東藥科大學附屬第一醫院住院和門診診斷為AAA 患者20例，其中男16例，女4例，平均年齡（64.850 ± 9.343）歲；體檢健康人20例，其中男15例，女5例，平均年齡（60.30 ± 9.24）歲［1］；同時收集在中國醫科大學附屬第一醫院血管/甲狀腺外科接受開放手術AAA 組患者腹主動脈組織標本10例；收集器官移植外科器官捐獻者正常腹主動脈組織標本10例。AAA 組：CT/3D-CTA 顯示腹主動脈瘤徑＞5.5 cm，其中E-D 綜合征、馬凡綜合征、其他已知的血管及結締組織疾病患者除外。健康對照組：超聲或CT 結果顯示無腹主動脈及其他血管、結締組織疾病人群。本研究的開展經廣東藥科大學附屬第一醫院倫理委員會批準，所有納入對象均簽署了項目知情同意書。

1.2 材料Human Fibulin 3（FBLN3）ELISA Kit 購自Bioswamp 公司；基質金屬蛋白酶2（MMP2）檢測試劑盒、基質金屬蛋白酶9（MMP9）檢測試劑盒均購自中國cloud-clone 公司；TRIzol Reagent 試劑購于美國Invitrogen 公司；Bestar?qPCR RT Kit（gDNA Remover）、Bestar?one step RT qPCR kit（Sybr Green）試劑購于中國DBI Bioscience 公司；Fibulin-3 Antibody、GADPH Antibody 購自中國ABGENT 公司；ECL 發光液購自美國Millpore 公司；PCR 引物由中國華大基因公司構建。

1.3 酶聯反應吸附測定（ELISA）法檢測收集血液，3 500 r/min 離心5 min，取上清操作。根據說明書比例稀釋標準品后加樣，37℃溫育1 h；棄去液體，再每孔加檢測溶液A 工作液，37℃溫育1 h；洗滌后每孔加檢測溶液B 工作液，37℃溫育30 min；洗板5次，加TMB 底物溶液，37℃避光顯色30 min；每孔加終止溶液終止反應，此時藍色立轉黃色。根據標準品作出標準曲線的直線回歸方程，再計算出對應的樣品濃度。

1.4 熒光定量PCR 檢測Trizol 提取血管組織中的總RNA，采用紫外分光光度計檢測樣本的OD值和濃度，取1 μg 總RNA 進行逆轉錄，2 μL 逆轉錄產物進行SYBR 熒光定量RT-PCR，按試劑盒說明書操作。95 ℃預變性1 min，95 ℃5 s、60 ℃1 min，40 個循環，然后95 ℃15 s、60 ℃30 s、95 ℃15 s 退火，內參選用GAPDH，實驗重復3 次取平均值，設至少3 個復孔。Fibulin-3 引物序列（5′-3′）：-上游：GTCACAGGACACCGAAGAAAC，-下游：TTGCATTGCTGTCTCACAGGA；GADPH 引物序列：-上游：GATCGTGGAAGGGCTAATGA，-下游：GACTTTGCCTACAGCCTTGG。mRNA 定量由Takara 公司實時熒光定量PCR 儀系統軟件分析。

1.5 Western blot收集血管壁后嚴格按照核蛋白提取試劑盒說明進行，取得的上清運用BCA 法測定蛋白濃度，配置10%的SDS-PAGE 凝膠，每個樣本上樣量為20 μg，電泳后進行200 mA 2 h 轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4°C 孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，用ECL 發光試劑孵育后使用化學發光成像儀獲取蛋白條帶。

1.6 統計學方法實驗數據的處理應用SPSS 20.0統計軟件及Graphpad prism7.0 統計學軟件進行統計學分析。計量數據均以均值±標準差表示。兩組間差異采用獨立樣本t檢驗，計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 基線資料的比較入選病例中AAA 組總膽固醇（TC）高于健康對照組，差異具有統計學意義（P＜0.001）；兩組間性別、年齡、是否吸煙、體質量指數（BMI）、是否有高血壓或糖尿病等臨床基本情況差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 血清中Fibulin-3、MMP-2 及MMP-9 表 達對兩組人群血清進行ELISA 實驗，結果表明，與健康對照組相比較，AAA 患者血清中Fibulin-3 表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。AAA 組血清中MMP-2 及MMP-9 的表達水平高于健康對照組，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

2.3 腹主動脈組織中Fibulin-3 的mRNA 表達RT-PCR 結果顯示，在AAA 患者組織中，Fibulin-3的相對表達量明顯低于對照組［（0.07 ± 0.02）vs.（1.00±0.02），t=31.42，P＜0.01］。以上結果提示，在mRNA 水平，Fibulin-3 在AAA 患者中表達降低。見圖1。

表1 入選病例臨床基礎資料比較Tab.1 Comparison of the clinical data of patients

表2 兩組血清中Fibulin-3、MMP-2 及MMP-9 表達量的比較Tab.2 Comparison of relative expression of Fibulin-3、MMP-2 and MMP-9 in two groups ±s，ng/mL

表2 兩組血清中Fibulin-3、MMP-2 及MMP-9 表達量的比較Tab.2 Comparison of relative expression of Fibulin-3、MMP-2 and MMP-9 in two groups ±s，ng/mL

注：**P ＜0.05

組別Fibuiln-3 MMP-2 MMP-9健康對照組（n=20）82.95±11.07 17.08±3.35 27.12±4.17 AAA 組（n=20）55.45±6.28**39.00±5.59**65.95±4.50**t 值9.48 14.94 27.97 P 值＜0.01＜0.01＜0.01

圖1 各組標本中Fibulin-3 的mRNA 相對表達量Fig.1 Comparison of relative expression of Fibulin-3 mRNA in two groups

2.4 腹主動脈組織中Fibulin-3的蛋白表達Western blot 結果顯示，在AAA 患者組織中，Fibulin-3 的蛋白相對表達量明顯低于健康對照組［（0.05±0.01）vs.（0.20 ± 0.02），t= 10.4，P＜0.01］。以上結果提示，在蛋白表達水平，Fibulin-3 在AAA 患者中表達降低。見圖2。

圖2 各組標本中Fibulin-3 的蛋白相對表達量Fig.2 Comparison of relative expression of Fibulin-3 protein in two groups

2.5 Fibulin-3預測腹主動脈瘤診斷的受試者ROC曲線分析血清ELISA 的Fibulin-3 ROC 曲線下面積為0.945，特異度和靈敏度分別為0.899 和0.995，具有較高的診斷價值。通過最大約登值確定Fibulin-3 對應的最佳臨界點為70.106 ng/mL。見表3。圖3。

表3 Fibulin-3 受試者ROC 曲線分析Tab.3 Analysis of ROC curves of Fibulin-3 in serum

3 討論

圖3 血清Fibulin-3 ROC 曲線圖Fig.3 ROC curve of Fibulin-3 in serum

AAA是最常見的高致死率血管外科疾病之一，當腹主動脈直徑擴張超過正常動脈直徑的50%時，即可診斷為AAA。細胞外基質（extracellular matrix，ECM）被破壞是AAA 關鍵的病理生理機制之一，其中彈力蛋白與膠原蛋白為ECM的主要成分，兩者在內環境中所保持的相對平衡是維持血管壁功能的原因之一，而與此機制聯系最緊密的是MMPs，MMPs 水平的下調可以抑制AAA 進展［16-18］。AAA 中的確存在著MMPs 的過表達情況，特別是MMP-2 和MMP-9 的表達水平升高［19］。MMPs 的過表達可以降解Ⅳ型膠原蛋白、蛋白聚糖核心蛋白和彈性蛋白，導致動脈瘤的發生。MMPs 活性及表達上升是AAA 典型的病理變化之一［20］，膠原蛋白被炎癥細胞分泌的大量MMPs 所降解，而膠原蛋白分解的產物又進一步的促使一系列不同的炎性細胞高表達，釋放炎癥因子介導ECM 及平滑肌細胞的減少，從而加重AAA；而動脈擴張的直接因素就是動脈脈壁中層彈性纖維的損傷和降解。有研究證實，AAA 中MMP-9 酶原的水平升高，蛋白水解酶的活性增加，且隨著MMP-9 酶原水平的升高，AAA 的破裂風險增加［21-22］。

現階段對于Fibulin-3 的研究主要集中在腫瘤、盆腔和眼睛黃斑變性等疾病的研究，對Fibulin-3 的功能的了解還處于早期，在心血管方面的研究尚且不多。筆者在前期研究中發現Fibulin-3 能修復高血壓損傷的內皮結構，通過給大鼠注射外源性Fibulin-3 蛋白后，可出現明顯的血壓降低，胸主動脈管壁厚度增加，彈性纖維橫徑増大，同時具有抑制血管壁中MMP-2、MMP-9 水平以及血管壁氧化應激作用［14，23］。本研究采用ELISA 實驗檢測AAA 患者血清中Fibulin-3 的表達情況，再次證實在AAA 組中表達顯著降低；血清中MMP-2 與MMP-9 水平升高，與之前的研究結果相同。Fibulin-3 基因過表達促進血管內皮細胞遷移、增殖和新生血管形成，Fibulin-3 可能是高血壓血管內皮損傷的修復因子［24］；AngII 抑制血管內皮細胞功能，并通過NF-κB 信號通路抑制內皮細胞Fibulin-3 基因的表達，Fibulin-3 基因對于維持血管內皮的生理功能具有重要作用［8，14，23，25］。近年研究發現血管內皮也直接或者間接參與了AAA 的病變，通過分泌多種物質調節血管壁中其他細胞的功能［26-28］。

本研究發現AAA 組患者TC 水平升高，提示TC水平的變化與AAA 的發生發展有一定關系，與馮國飛等［29］研究結果一致。同時本研究對兩組臨床標本進行熒光定量PCR 及Western blot 實驗檢測Fibulin-3 情況，結果表明Fibulin-3 在AAA 患者中也明顯低于健康人群水平，該結果與ELISA 結果相同。這表明在血管壁中，也存在Fibulin-3 水平增高會導致MMP-2 和MMP-9 水平的降低，反之，Fibulin-3 表達量的減少，則可能導致MMP-2、MMP-9 等MMPs 水平升高，使得腹主動脈壁中膠原蛋白及彈力蛋白減少，從而使得動脈壁逐漸進一步擴張惡化形成動脈瘤。

曲線下面積（AUC）大小反映ROC 的價值，當AUC 值處于0.7～0.9 之間提示評估試驗的準確性高，數值越接近1 越理想［30］。本研究中對于血清Fibulin-3 ROC 曲線分析結果提示，其具有較高的預測價值，準確度較高。但因其臨床數據納入較少，導致其數據穩定性和變異性有一定差異，下一步應該擴大樣本量進行研究，可進一步增強數據的準確性，完善臨床研究的方案。

綜上所述，Fibulin-3 可能在AAA 的發病中具有十分重要的作用，且對AAA 的形成具有一定的預測價值。