高危型人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA檢測在宮頸癌篩查中的分流意義

趙涌 強(qiáng)克萍 馬紀(jì)紅 蔣海佳 哈春芳

寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)中心宮頸病變篩查中心實(shí)驗(yàn)室（銀川750004）

子宮頸癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第3 位，在世界范圍內(nèi)每年約有53 萬新發(fā)病例和27.5萬死亡病例［1］。2015年我國子宮頸癌每年新發(fā)病例9.89 萬，死亡病例為3.05 萬［2］。自從20 世紀(jì)40年代進(jìn)行子宮頸癌篩查以來，即通過巴氏涂片行宮頸細(xì)胞學(xué)檢查，美國的子宮頸癌發(fā)病率較1950年相比減少了85%［3］。2009年以來，隨著我國農(nóng)村婦女子宮頸癌及乳腺癌篩查項(xiàng)目（即兩癌篩查）的推廣及深入，子宮頸癌篩查越來越受到重視。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）DNA檢測技術(shù)被廣泛地應(yīng)用，其敏感度高［4-5］，能彌補(bǔ)細(xì)胞學(xué)的不足，但是對于細(xì)胞學(xué)檢查中未明確診斷意義的不典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASCUS）、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）和不除外高度病變的不典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASC-H）患者的分流管理，仍不滿意。研究［6-7］表明HPV E6/E7 癌基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是宮頸組織HPV 持續(xù)感染和惡變所必須的，可作為反映宮頸病變進(jìn)展的臨床標(biāo)志物。國外研究［8-11］顯示，HPV E6/E7 mRNA 檢測方法相比HPV DNA檢測具有更高的特異度和相似的敏感度。國內(nèi)學(xué)者研究［12-14］表明HPV E6/E7 mRNA 的表達(dá)與宮頸病變程度密切相關(guān)，但對于細(xì)胞學(xué)陽性的患者分流意義的研究尚不夠充分，能否將其用于陽性患者的分流還需要更多的臨床研究證實(shí)。本研究通過對比HPV E6/E7 mRNA 和HPV DNA 檢測在ASCUS/LSIL/ASC-H 中的診斷效能，探討HPV E6/E7 mRNA 對高級別子宮頸病變的診斷價值，以期為臨床分流管理提供思路。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2016年7月至2019年5月在寧醫(yī)大總院婦科門診接受子宮頸癌篩查的患者156例，其年齡為22～76歲，平均（43±10）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查（thinprep cytologic test，TCT）結(jié)果為ASCUS、LSIL、ASC-H 者；（2）在TCT 取樣后3 個月內(nèi)接受陰道鏡檢查及活檢；（3）采用第2 代雜交捕獲技術(shù)（HC-2）行高危型HPV DNA 檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往曾接受過治療的癌前病變或?qū)m頸癌患者；（2）合并妊娠者；（3）合并其他惡性腫瘤疾病；（4）有自身免疫性疾病或正在接受免疫抑制治療的患者。

1.2 方法（1）HPV E6/E7 mRNA 檢測：使用鄭州Kodia 生物技術(shù)公司生產(chǎn)的Quanti Virus HPV E6/E7 mRNA 診斷試劑盒，采用支鏈DNA 雜交技術(shù)，針對14 種高危型HPV（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66 和68）定量檢測。最終經(jīng)冷光儀檢測樣本的光子數(shù)，通過軟件計(jì)算得（RLU/CO）值，比值越高說明其病毒載量越高。按照其比值高低分為陰性組（＜1.00）、低載量組（1.00～5.00）、中載量組（5.00～20.00）和高載量組（≥20.00）。（2）TCT 檢測：使用美國BD 公司生產(chǎn)的surepath 全自動超薄液基細(xì)胞學(xué)制片系統(tǒng)，由宮頸病變篩查中心細(xì)胞學(xué)專職人員負(fù)責(zé)細(xì)胞學(xué)診斷，結(jié)果判定參照2001年Bethesda 系統(tǒng)分類標(biāo)準(zhǔn)。（3）高危型HPV DNA 檢測：采用美國DIGENE 公司生產(chǎn)的第二代雜交捕獲試驗(yàn)（HC-2）試劑及配套設(shè)備，定性檢測子宮頸脫落細(xì)胞樣本中的13 種高危型HPV（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59 和68），陽性結(jié)果截止值為1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Mantel-Haenszel χ2檢驗(yàn)計(jì)算病毒載量與病理等級之間的線性關(guān)系。采用敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及ROC 曲線下面積對HPV E6/E7 mRNA 檢測的篩查效能進(jìn)行描述。

2 結(jié)果

2.1 HPV E6/E7 mRNA 與細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)結(jié)果的關(guān)系TCT 結(jié)果顯示，HPV E6/E7 mRNA 檢測的總陽性率為68.6%，在ASCUS 中為64.4%（56/87），在LSIL 中為60.6%（20/33），在ASC-H 中為86.1%（31/36）。ASCUS 和LSIL 組分別與ASC-H 組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.675，P=0.031；χ2=4.738，P= 0.029）。陰道鏡活檢后病理診斷為低級別子宮頸病變即CINⅠ-（包括正常子宮頸和CINⅠ）的患者中HPV E6/E7 mRNA 檢測的陽性率為53.7%（51/95），高級別子宮頸病變即CINⅡ+（包括CINⅡ、CINⅢ和SCC）中為91.8%（56/61），兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=25.054，P＜0.001），見表1。

表1 HPV E6/E7 mRNA 與細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)結(jié)果的關(guān)系Tab.1 Relationship between HPV E6/E7 mRNA and cytology and pathology results例（%）

2.2 各級子宮頸病變中HPV E6/E7 mRNA病毒載量的分布病理診斷正常組中HPV E6/E7 mRNA表達(dá)陰性者占比為49.3%，而隨著病理診斷級別的升高，所占比例明顯下降，在CINⅠ和CINⅡ+中分別為38.5%和8.2%。同時隨著病理診斷級別的升高，病毒載量為低、中載量的患者不斷增加，其中，病理正常組中低、中載量患者占37.7%，CINⅠ中為53.8%，CINⅡ+中為67.2%。Mantel-Haenszel χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示HPV E6/E7 mRNA 病毒載量與病理等級之間存在線性關(guān)系（χ2= 17.969，P＜0.001。Pearson 相關(guān)結(jié)果顯示，R= 0.34，P＜0.001），說明病變級別隨著HPV E6/E7 mRNA 病毒載量的增加而升高，見表2。

表2 HPV E6/E7 mRNA 病毒載量的分布及其與子宮頸病變各級之間的關(guān)系Tab.2 Distribution of HPV E6/E7 mRNA viral load and its relationship with all levels of cervical lesions例（%）

2.3 HPV E6/E7 mRNA 與HC-2 檢測的比較156例納入患者均同時行HPV E6/E7 mRNA與HC-2檢測，其中61例CINⅡ+中HPV E6/E7 mRNA 表達(dá)陽性者為56例，靈敏度為91.8%；HC-2 檢測陽性者為61例，靈敏度為100%。95例CINⅠ-中HPV E6/E7 mRNA 檢測陰性為44例，特異度為46.3%；HC-2檢測陰性為15例，特異度為15.7%，二者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.674，P＜0.001）。156例樣本中HPV E6/E7 mRNA 與HC-2 二者檢測的一致性為118/156（75.6%），見表3。

表3 HPV E6/E7 mRNA 與HC-2 檢測的比較Tab.3 Comparison of HPV E6/E7 mRNA and HC-2例

2.4 HPV E6/E7 mRNA 與HC-2 檢測效能的比較以宮頸活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，HPV E6/E7 mRNA與HC-2 檢測CINⅡ+的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值，見表4。HPV E6/E7 mRNA與HC-2兩種檢測方法的ROC 曲線下面積為0.713 和0.628。當(dāng)約登指數(shù)取最大值時，HPV E6/E7 mRNA檢出CINⅡ+的最佳診斷臨界值為1.365，其診斷敏感度為88.5%，特異度為51%，見圖1。

表4 HPV E6/E7 mRNA 與HC-2 檢測效能的比較Tab.4 Comparison of detection efficiency of HPV E6/E7 mRNA and HC-2%

圖1 HPV E6/E7 mRNA 與HC-2 檢出CINⅡ+的ROC 曲線Fig.1 The ROC curve of CINⅡ+detected by HPV E6/E7 mRNA and HC-2

3 討論

高危型HPV 持續(xù)感染是引起女性宮頸上皮內(nèi)瘤變并向?qū)m頸癌進(jìn)展的首要原因［15］。HPV DNA 檢測聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查被廣泛應(yīng)用于宮頸癌初篩中，有效提高了敏感性［16］。但局限性也隨之凸顯，存在特異度較低的問題。研究［17］表明E6/E7 癌基因的表達(dá)是宮頸HPV 感染并向高級別病變進(jìn)展的臨床標(biāo)志，其作為分流標(biāo)志物受到了研究者的關(guān)注。

本研究結(jié)果顯示，在細(xì)胞學(xué)篩查陽性患者中，HPV E6/E7 mRNA 檢測技術(shù)的特異度在以CINⅡ+為研究終點(diǎn)時，顯著高于HC-2 方法，而靈敏度相似，分流效果優(yōu)于HC-2方法。這與ZHANG 等［18］和ZHU 等［19］研究結(jié)論相似。前者是基于E6/E7 mRNA檢測的AHPV（APTIMA HPV）方法與Cobas 比較，AHPV展現(xiàn)了更高的特異性（41%，13%）。ZHU等［19］評估ASCUS患者中HPV E6/E7 mRNA（Quanti Virus）的分流價值中認(rèn)為HPV E6/E7 mRNA 具有更高的特異性，并且不降低敏感性。綜上分析，E6/E7 mRNA 檢測相對較高的特異性可能與HPV DNA整合入細(xì)胞后表達(dá)E6/E7顯著增加有關(guān)。對HPV E6/E7 mRNA 檢測結(jié)果按其比值高低分組，研究顯示在各級病變中E6/E7 mRNA 病毒載量分布不同，宮頸病變的程度有隨病毒載量升高而升高的趨勢，與以往研究［20］結(jié)果一致。BRUNO 等［21］在對ASCUS 和LSIL 的患者進(jìn)行為期3年的隨訪中發(fā)現(xiàn)，在HPV E6/E7 mRNA 測試中呈陽性的婦女宮頸病變的惡性發(fā)展風(fēng)險更高。因此在臨床工作中對于細(xì)胞學(xué)陽性合并E6/E7 mRNA 檢測陽性且病毒載量較高的患者應(yīng)高度重視，對該類患者應(yīng)及時抗病毒治療并加大隨訪力度，進(jìn)而起到早發(fā)現(xiàn)早治療的作用。

本研究中HPV E6/E7 mRNA 檢測的陽性率在細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)檢查中均低于HC-2 方法，按照目前的轉(zhuǎn)診策略即細(xì)胞學(xué)陽性合并HPV DNA 陽性積極轉(zhuǎn)診陰道鏡，HPV E6/E7 mRNA 檢測方法將大大降低轉(zhuǎn)診率，為臨床醫(yī)師減輕工作負(fù)擔(dān)。相對HC-2 較低的陽性率為其分流作用提供了潛在的支持，同時也避免了因較高的HPV DNA 感染率而導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)輕度異常患者過度醫(yī)療的可能。比較ROC 曲線下面積進(jìn)一步證實(shí)HPV E6/E7 mRNA 具有較好的診斷價值。對ROC 曲線分析得知，HPV E6/E7 mRNA 取值為1.365 時為最佳截斷值，其檢測特異性得到一定提高。鑒于此，臨床工作中可考慮在此最佳閾值對高危人群予以分流，這對于減輕一過性感染患者不必要的精神負(fù)擔(dān)和提高宮頸癌篩查效率有重要意義。

本研究的局限性其一在于樣本量不夠充分，尤其是LSIL 組樣本過少，且在分析中HPV E6/E7 mRNA 陽性率并沒有隨著ASCUS、LSIL、ASC-H 理想地逐級遞增，也許樣本量少是其中可能存在的一種因素。本研究的局限性在于本次數(shù)據(jù)源于單次的橫斷面檢測，而不是連續(xù)隨訪的前瞻性研究，不能確定這些高病毒載量是否會持續(xù)存在以及其對宮頸病變進(jìn)展或逆轉(zhuǎn)的影響。提示應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并對初始病理診斷為CINⅠ-的患者加以隨訪以觀察HPV E6/E7 mRNA 的預(yù)測及診斷價值。