利于嗜熱脂肪芽孢桿菌平板計數的培養方法

萬愛玉 劉璇 萬欣

摘要：本文研究了嗜熱脂肪芽孢桿菌平板計數方法，通過培養基類型、平板培養基的使用量，培養時的溫濕度及時間的控制，使得嗜熱脂肪芽孢桿菌能夠在平板上形成可觀察的單菌落，利于進行計數。

關鍵詞：嗜熱脂肪芽孢桿菌；培養基；平板計數

嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermo—philus）屬嗜熱性需氧芽孢桿菌，但兼有厭氧的特性。該菌株運動性強，培養溫度高，在平板上生長擴散快，很難形成單菌落[1]。

購買來的生物指示劑，要對其芽孢量進行測定，以判斷是否符合滅菌程序的驗證要求。為此對利于嗜熱脂肪芽孢桿菌平板計數的培養方法進行了研究，以方便進行生物指示劑的孢子量確認。

一、材料和方法

（一）菌種

嗜熱脂肪芽孢桿菌ATCC7953（壓力蒸汽滅菌生物指示劑，D121值1.3-1.9），孢子量F0≥8（103/只）。

（二）培養基

1.營養瓊脂培養基（g/L）：蛋白胨10.0，牛肉浸出粉3.0，氯化鈉5.0，瓊脂14.0，pH值7.2±0.2（25'E）。121℃高壓滅菌15分鐘備用。

2.胰酪大豆胨瓊脂培養基（g/L）：胰酪胨15.0，大豆木瓜蛋白酶消化物5.0，氯化鈉5.0，瓊脂15.0，pH值7.3±0.2（25℃）。121℃高壓滅菌15分鐘備用。

3.溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基（g/L）：蛋白胨10.0，葡萄糖5.0，溴甲酚紫0.012，pH值7.0-7.2（25℃）。115℃高壓滅菌30分鐘備用。

（三）方法

將孢子量為103/只的嗜熱脂肪芽孢桿菌ATCC7953（壓力蒸汽滅菌生物指示劑）用0.9%氯化鈉溶液十倍稀釋法稀釋[2]，取O.1ml適當稀釋度的菌懸液涂布于營養瓊脂培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基平板上，置于不同條件下培養。

二、結果

（一）培養基類型

嗜熱脂肪芽孢桿菌對培養基的要求較低，本實驗室所使用計數培養基通常為營養瓊脂培養基和胰酪大豆胨瓊脂培養基，考慮到嗜熱脂肪芽孢桿菌的特殊性，經查閱資料，將溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基加入選擇當中。

在其它培養條件相同的情況下針對營養瓊脂培養基、胰酪大豆胨瓊脂培養基、溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基三種培養基進行了研究，結果發現營養瓊脂培養基及胰酪大豆胨瓊脂培養基在培養溫度較高時培養基凝固效果不理想，較難形成肉眼可識別的單菌落無法進行計數。嗜熱脂肪芽孢桿菌在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨瓊脂上生長良好，單菌落明顯且呈米黃色，與培養基的紫色形成對比，有利于計數。

（二）平板培養基的量

通常制備平板培養基所需的培養基的量為15-20ml，但由于嗜熱脂肪芽孢桿菌的培養溫度較高，水分蒸發較快，如果培養基的量較少，平板培養基易干裂。培養基的量確定為25ml。

（三）培養濕度控制的選擇

培養基在高溫下培養，若培養濕度過大，菌落擴散很快，會分布整個平板，很難形成單菌落。但濕度太小，平板易于裂。

針對濕度過大處理方案為33℃預培養2天，蒸發平板表面水分后使用。針對防止培養濕度過小處理方案為培養時在培養箱中放置裝有100ml純化水，以調節培養箱內濕度，防止平板干裂。

（四）培養溫度

嗜熱脂肪芽孢桿菌最低生長溫度為28℃，最高生長溫度70～77℃，最適生長繁殖溫度為56～65℃。55℃培養24小時后可形成單菌落，但菌落過小，65℃培養24小時后菌落成片生長，均不利于計數。而60℃培養24小時后形成的單菌落大小合適，利于肉眼計數且未成片生長。

（五）培養時間

60℃培養18小時后形成較小的單菌落，肉眼計數較困難。培養24小時后形成的單菌落大小合適，利于肉眼計數。培養32小時后菌落成片生長不利于計數。

三、討論

嗜熱脂肪芽孢桿菌由于培養時需要的溫度較高，導致水分蒸發較快，因此要注意培養時的溫濕度控制，并通過調整培養基的類型及平板的厚度使得其能在合適的培養時間得到肉眼可見且不擴散的單菌落，從而達到利于計數的目的。

參考文獻：

[1]任香蕓，陳濟琛，蔡海松，林新堅，邱宏端.嗜熱脂肪土芽孢桿菌CHB1生長特性與培養條件研究[J].生物技術，2007（02）.

[2]李華.平板菌落計數的改進方法[J].生物學通報，2006（01）.