miR-24-3p靶向HAP1基因對STZ誘導胰島β細胞凋亡的影響

付莎莉 王莉 付阿丹 李娜

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢市中心醫院內分泌科，湖北 武漢 430000)

胰島β細胞功能受損是引發2型糖尿病的主要因素，而細胞凋亡是促使胰島β細胞功能異常的重要原因，胰島β細胞凋亡可通過破壞胰島結構及降低其功能進而促使患者血糖升高〔1，2〕。因而探討胰島β細胞凋亡發生機制對有效提高2型糖尿病患者治療效果具有重要研究價值。研究表明1型和2型糖尿病患者的血漿中微小RNA(miR)-24水平升高〔3，4〕。在肥胖相關的糖尿病小鼠的胰島中miR-24的表達明顯高于對照組，過表達miR-24會導致胰島β細胞的胰島素分泌功能障礙并抑制胰島β細胞增殖〔5〕。然而，miR-24-3p在鏈尿佐菌(STZ)誘導的胰島β細胞凋亡過程中的表達未見相關報道。通過靶基因預測軟件分析亨廷頓蛋白相關蛋白(HAP)1可能是miR-24-3p的靶基因，研究表明沉默 HAP1 表達可增加小鼠胰島β細胞株NIT細胞凋亡，同時也能促進STZ誘導的胰島NIT 細胞的凋亡〔6〕。本研究擬探討miR-24-3p是否通過靶向調節HAP1表達影響STZ誘導的胰島NIT 細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1主要試劑 STZ購自美國Sigma公司；小鼠胰島β細胞系NIT購自上海通派生物科技有限公司；RPMI1640培養基購自上海博升生物科技有限公司；胎牛血清購自北京全式金生物技術有限公司；miR-24-3p mimic、miR-24-3p抑制劑(anti-miR-24-3p)及其對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1載體購自美國Invitrogen公司；LipofectamineTM2000 轉 染 試 劑 盒購自上海慧穎生物科技有限公司；聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；雙熒光素酶報告基因質粒(pGL3載體)購自上海漢恒生物科技有限公司；雙熒光報告系統購自美國Promega公司；細胞裂解液購自北京奧維亞生物技術有限公司；Annexin V/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒購自美國Life公司；HAP1 siRNA及si-NC均購自山東維真生物科技有限公司；HAP1抗體購自美國Sigma公司；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2與Bcl-2相關X抗體(Bax)抗體均購自美國Abcam公司；活化的半胱氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)-3抗體購自美國CST公司；辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白(Ig)G二抗購自美國Thermo公司。

1.2胰島β細胞培養及轉染 取出凍存胰島β細胞NIT，接種于6孔板(2×105個細胞/ml)，置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基，放入37℃、5%CO2培養箱培養，轉染前1 d更換為不含胎牛血清的RPMI1640培養基，分別將anti-miR-NC、anti-miR-24-3p、pcDNA 、pcDNA-HAP1轉染入NIT細胞，轉染6 h后更換RPMI1640完全培養基。轉染過程均嚴格按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書進行操作。

1.3胰島β細胞處理及分組 選取對數生長期NIT分為Con組、STZ組，其中Con組NIT細胞不進行任何處理，STZ組NIT細胞中加入5 mmol/L STZ作用24 h〔7〕。收集轉染后12 h的NIT細胞，分別加入5 mmol/L STZ作用24 h，分別為STZ+anti-miR-NC組、STZ+anti-miR-24-3p組、STZ+pcDNA組、STZ+pcDNA-HAP1組。為了驗證HAP1與miR-24-3p在STZ誘導的胰島β細胞凋亡過程中的作用，分別將si-NC、si-HAP1與anti-miR-24-3p共同轉染NIT細胞，12 h后分別加入5 mmol/L STZ作用24 h，分別為STZ+anti-miR-24-3p+si-NC組、STZ+anti-miR-24-3p+si-HAP1組。

1.4實時熒光定量(qRT)-PCR實驗 用Trizol法提取各組NIT細胞總RNA，利用紫外分光光度計測定RNA濃度與純度(1.8≤A260/A280≤2.0)，分別取2 μl RNA進行反轉錄合成cDNA，采用qRT-PCR檢測miR-24-3p 、HAP1 mRNA表達水平，反應體系20 μl：2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，50×ROX Reference 0.4 μl，ddH2O 補足至20 μl。PCR反應程序設置為95℃預變性5 min循環1次，95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共循環40次。根據PCR儀分析軟件計算miR-24-3p 、HAP1 mRNA相對表達量。

1.5Western印跡實驗 提取各組NIT細胞總蛋白，定量蛋白，以每孔30 μg蛋白樣加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)孔內，將分離蛋白凝膠轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，采用脫脂奶粉封閉，2 h后分別加入HAP1、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3蛋白一抗(1∶1 000)，4℃避光孵育，過夜，分別加入二抗(1∶5 000)，用電化學發光液(ECL)顯影，曝光，置于凝膠成像分析系統分析各蛋白條帶并應用Quantity one軟件分析蛋白條帶灰度值，HAP1、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3均以GAPDH為內參基因。實驗均重復3次。

1.6雙熒光素酶報告實驗 收集對數生長期NIT細胞，接種于24孔細胞培養板，分別將野生型(WT)-HAP1、突變型(MUT)-HAP1與miR-NC、miR-24-3p mimic共轉染，24 h后利用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測細胞熒光素酶活性，棄各孔培養基，分別加入細胞裂解液，搖床振蕩1 h后分別收集細胞裂解液，置于離心機離心1 min(1 200 r/ min轉速)，接種于96孔細胞培養板，嚴格按照熒光素酶檢測試劑盒說明書操作并檢測細胞相對熒光素酶活性。

1.7流式細胞術實驗 取1.3中各組NIT細胞，胰蛋白酶消化，預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，加入500 μl結合緩沖液重懸細胞，依次分別加入5 μl Annexin V-異硫氰酸FITC、PI，混勻后室溫避光孵育5 min，置于流式細胞儀檢測各組NIT細胞凋亡率。

1.8統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、χ2檢驗。

2 結 果

2.1STZ對胰島β細胞中miR-24-3p和HAP1表達的影響 STZ組胰島β細胞中miR-24-3p相對表達量相較于Con組明顯升高(P<0.001)，而HAP1 mRNA及蛋白表達均明顯降低(P<0.001)，見圖1、表1。表明STZ可促使胰島β細胞中miR-24-3p表達上調，HAP1表達下調，由此推測miR-24-3p與HAP1可能存在負向調控關系。

圖1 HAP1蛋白表達

表1 STZ對胰島β細胞中miR-24-3p和HAP1表達的影響

2.2miR-24-3p靶向調控HAP1的表達 HAP1可能為miR-24-3p的靶基因，見圖2A。雙熒光素酶報告實驗驗證miR-24-3p與HAP1的靶向關系，miR-24-3p mimic與WT-HAP1基因3′非翻譯區(UTR)報告基因載體共轉染時，胰島β細胞NIT的熒光素酶活性明顯被抑制(P<0.001)，而miR-24-3p mimic與WT-HAP1基因3′UTR報告基因載體共轉染時，NIT細胞熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，見表2。在NIT細胞中轉染miR-24-3p mimic后，miR-24-3p組HAP1蛋白(0.16±0.03)顯著低于miR-NC組(0.57±0.05，P<0.05)；而轉染miR-24-3p抑制劑后anti-miR-24-3p組HAP1蛋白(0.89±0.08)顯著高于anti-miR-NC組(0.58±0.05，P<0.05)，見圖2B。表明HAP1是miR-24-3p的靶基因，miR-24-3p可負向調控靶基因HAP1表達。

A：HAP1的3′UTR中含有與miR-24-3p互補的核苷酸序列；B：HAP1蛋白表達圖2 miR-24-3p靶向調控HAP1的表達

表2 雙熒光素酶報告實驗

2.3抑制miR-24-3p表達對STZ誘導的胰島β細胞凋亡的影響 STZ組NIT細胞凋亡率明顯高于Con組(P<0.05)，表明STZ可促使胰島β細胞凋亡。與STZ+anti-miR-NC組相比，STZ+anti-miR-24-3p組NIT細胞凋亡率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達下調(P<0.05)，見圖3、圖4、表3。表明STZ可能通過上調miR-24-3p表達進而促進胰島β細胞凋亡。

1～4：Con組、STZ組、STZ+anti-miR-NC組、STZ-anti-miR-24-3p；圖5同圖3 Western印跡檢測Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達

圖4 抑制miR-24-3p表達對STZ誘導的胰島β細胞凋亡的影響

表3 抑制miR-24-3p表達對STZ誘導的胰島β細胞凋亡的影響

2.4HAP1過表達對STZ誘導的胰島β細胞凋亡的影響 與STZ+pcDNA組相比，STZ+pcDNA-HAP1組NIT細胞中HAP1蛋白表達明顯上調(P<0.05)，提示HAP1過表達NIT細胞株構建成功。相較于STZ+pcDNA組，STZ+pcDNA-HAP1組NIT細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達水平降低(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達水平升高(P<0.05)，見表4、圖5。表明HAP1過表達可能通過上調Bcl-2蛋白表達并促使Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達下調進而抑制STZ誘導的胰島β細胞凋亡。

表4 HAP1過表達對STZ誘導的胰島β細胞凋亡的影響

圖5 HAP1和凋亡相關蛋白表達

2.5抑制HAP1表達逆轉了抑制miR-24-3p表達 對STZ誘導的胰島β細胞凋亡的作用 STZ+anti-miR-24-3p+si-HAP1組NIT細胞中HAP1蛋白表達明顯低于STZ+anti-miR-24-3p+si-NC組(P<0.05)，表明抑制miR-24-3p表達可拮抗STZ對HAP1蛋白表達的抑制作用。與STZ+anti-miR-24-3p+si-NC組相比，STZ+anti-miR-24-3p+si-HAP1組NIT細胞凋亡率及Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，見表5、圖6。表明抑制HAP1表達可提高STZ對miR-24-3p表達的促進作用進而促進胰島β細胞凋亡。

表5 抑制HAP1表達逆轉了抑制miR-24-3p表達對STZ誘導的胰島β細胞凋亡的作用

1～4：STZ+anti-miR-NC組、STZ+anti-miR-24-3p組、STZ+anti-miR-24-3p+si-NC組、STZ+anti-miR-24-3p+si-HAP1組圖6 HAP1和凋亡相關蛋白表達

3 討 論

胰島素抵抗與胰島β細胞功能紊亂均為2型糖尿病發病機制，而胰島β細胞凋亡可促使其功能紊亂，同時還可促使胰島素細胞數量減少〔8，9〕。因而保護胰島β細胞及避免其細胞凋亡是治療2型糖尿病的關鍵環節。miR具有調節細胞增殖、分化及凋亡的作用，研究表明miR表達異常與胰島β細胞凋亡有關〔10〕。miR-24可通過抑制Neurodl蛋白表達進而抑制小鼠胰島β細胞系MIN6細胞數量及胰島素分泌〔11〕。研究表明，miR-24可通過抑制細胞周期依賴蛋白激酶(Cdk)4、細胞周期蛋白(Cyclin)D3 蛋白表達進而抑制胰島β細胞增殖，Cdk4、CyclinD3 過表達后可逆轉這一效應，但關于其具體作用機制仍需探究〔12，13〕。1型與2型糖尿病患者血清中miR-24-3p表達上調并可參與疾病進展過程〔14，15〕。胰島β細胞凋亡的主要途徑為線粒體凋亡途徑，Bax與Bcl-2異常表達可增加線粒體外膜通透性進而促使細胞內細胞色素C釋放至細胞外，細胞色素C又可激活caspase-3等進而促使細胞凋亡〔16，17〕。提示抑制miR-24-3p表達可通過降低Bax、cleaved-caspase-3蛋白表達而上調Bcl-2蛋白表達進而抑制線粒體凋亡途徑最終抑制胰島β細胞凋亡。

HAP1可廣泛分布于機體甲狀腺、胰島等組織器官，研究顯示，HAP1可在胰島β細胞及大鼠β細胞瘤細胞系中特異性表達，HAP1表達異常可影響胰島β細胞分泌胰島素的功能〔18，19〕。研究發現，HAP1可通過抑制神經元細胞凋亡進而保護神經元〔20〕。但HAP1是否也可通過抑制胰島β細胞凋亡進而發揮保護作用仍未可知。本研究說明HAP1表達降低可能促使胰島β細胞凋亡，HAP1過表達可能通過上調Bcl-2蛋白表達并促使Bcl-2/Bax比例失衡導致線粒體凋亡途徑失活進而對胰島β細胞發揮抗凋亡作用。抑制HAP1表達可逆轉抑制miR-24-3p表達對STZ誘導的胰島β細胞凋亡的作用。提示miR-24-3p可直接靶向調控HAP1表達進而促進胰島β細胞凋亡。