膽固醇轉運抑制劑U18666A對星形膠質細胞β-分泌酶含量及活性的影響

楊宏艷 都曉輝 包亞男 韓云峰

(齊齊哈爾醫學院 1藥學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2公共衛生學院)

阿爾茨海默病(AD)是一種以進行性認知功能障礙和記憶力損害為主的中樞神經系統退行性疾病，主要病理特征為細胞外β淀粉樣斑塊沉積、細胞內神經纖維纏結和大量神經元的丟失。膽固醇對于神經元的發展及突觸彈性和功能的維持起重要作用。流行病學資料顯示，體內膽固醇水平升高與AD發病相關，降低細胞內膽固醇水平或改變體內膽固醇的分布能降低AD的發生〔1～4〕。U18666A(UA)為膽固醇轉運抑制劑，被廣泛用來研究膽固醇和淀粉樣前體蛋白(APP)代謝的關系〔5,6〕。本研究以原代培養的星形膠質細胞為研究對象，觀察UA對星形膠質細胞APP、β-分泌酶(BACE)的含量與活性及β淀粉樣蛋白(Aβ)生成的影響，探討UA對APP代謝的調節，為AD的發病機制研究及治療提供新的視角。

1 材料和方法

1.1試劑 UA購自美國Enzo Life Sciences公司；BACE活性熒光檢測試劑盒購自Abcam公司；Fillipin購自Sigma公司；Aβ1～42酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自Life Technologies公司；APP 抗體和BACE1抗體購自Abcam 公司；β-actin 抗體、辣根標記山羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG購自北京中山金橋生物有限公司。

1.2儀器 CO2培養箱(美國 Thermo 公司)，酶標儀 Thermo 3001(美國 Thermo 公司)，倒置熒光顯微鏡(德國 ZEISS 公司)，電泳儀和全功能熒光化學發光成像儀(美國 Bio-Rad 公司)。

1.3細胞培養 大鼠原代星形膠質細胞購自ScienCell 公司。細胞培養在含有2%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素溶液和1%星形膠質細胞生長輔助因子(AGA)的AM-a培養基中，置于 5% CO2的37 ℃ 培養箱中培養。每2～3 d換液 1 次。

1.4Fillipin染色測定星形膠質細胞內膽固醇分布 星形膠質細胞按照2×105/ml密度接種于鋪有小玻片的24孔板中(小玻片需提前用多聚賴氨酸包被)，置于37℃培養箱中培養。待細胞生長至80% 融合時，加入5 μg/ml的UA作用24 h，棄去培養基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，加入4% 多聚甲醛室溫固定20 min，PBS漂洗后加入125 μg/ml Fillipin，避光孵育1 h。PBS洗3次后，取出玻片扣在滴有封片劑的載玻片上，熒光顯微鏡拍照觀察膽固醇的分布。

1.5Western印跡測定APP及BACE1蛋白表達 星形膠質細胞培養在75 cm2培養瓶中，加入1、3、5 μg/ml UA作用24 h，收集細胞，加入RIPA 裂解液冰上裂解 30 min，按照本組實驗方法提取蛋白〔7〕。配制10%分離膠和5%濃縮膠，加入等量蛋白樣品(15 μg/L)電泳，轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h后，一抗孵育：anti-APP(1∶5 000)，anti-BACE1(1∶2 000)，4℃過夜。辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000) 室溫孵育1 h后，TBST洗3次，化學發光液顯影成像。用 Quantity-One 軟件分析結果。

1.6熒光法檢測BACE活性 星形膠質細胞培養在75 cm2培養瓶中，加入5 μg/ml UA作用24 h，PBS沖洗細胞，加入100 μl提取緩沖液，冰上裂解30 min，4℃，12 000 r/min，離心5 min，收集上清，采用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量，調整蛋白濃度為25 μg/ml。按照試劑盒說明，設置空白孔、陽性對照孔、陰性對照孔和樣品孔。每孔加入50 μl反應緩沖液，陽性對照孔加入2 μl活性BACE，陰性對照孔加入2 μl BACE抑制劑，37℃ 預孵育10 min后，除空白孔外，其余各孔加入2 μl底物，混勻，37℃避光孵育1 h，在激發波長335 nm，發射波長495 nm檢測16 h內連續的熒光強度變化，計算BACE活性。每組設2個復孔，實驗重復4次。

1.7ELISA檢測星形膠質細胞Aβ1～42含量 UA(1、3、5 μg/ml)作用星形膠質細胞24 h后，收集細胞，提取蛋白。按照試劑盒說明書設立空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100 μl，余孔分別加標準品或待測樣品100 μl，37℃反應120 min，甩干液體，每孔加生物素抗體工作液100 μl，37℃孵育60 min，洗板，加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100 μl， 溫育60 min后，洗板，每孔加入底物溶液90 μl，37℃避光顯色30 min，加入終止液50 μl，450 nm酶標儀測量各孔的光密度值，計算細胞內Aβ1～42含量。每組2個復孔，實驗重復3次。

1.8統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件進行單因素方差分析、LSD檢驗、重復測量方差分析。

2 結 果

2.1UA對星形膠質細胞膽固醇分布的影響 Fillipin染色結果顯示，在未加入UA的對照組中呈現微弱的熒光；5 μg/ml UA作用星形膠質細胞24 h后，藍色熒光明顯增強，并呈點狀聚集。提示UA引起星形膠質細胞膽固醇明顯蓄積。見圖1。

圖1 UA對星形膠質細胞膽固醇分布的影響

2.2UA對星形膠質細胞APP及BACE1蛋白表達的影響 與對照組(100.00±1.27)相比，3、5 μg/ml UA作用于星形膠質細胞24 h，APP蛋白表達(125.40±8.27、153.60±10.09)明顯增加(P<0.05，P<0.01)，呈劑量依賴性；BACE1蛋白表達沒有明顯改變。見圖2。

1～4：對照組、1、3、5 μg/ml UA組圖2 UA對星形膠質細胞APP蛋白及BACE1蛋白表達的影響

2.3UA對星形膠質細胞BACE活性的影響 與對照組相比，5 μg/ml UA作用于星形膠質細胞24 h后，BACE的活性明顯增強(P<0.05)。見圖3。

2.4UA對星形膠質細胞Aβ1～42含量的影響 ELISA實驗結果顯示，3、5 μg/ml UA作用星形膠質細胞24 h后，與對照組(100.00±8.35)相比，Aβ1～42含量(135.71±5.18、156.09±17.62)明顯增加(P<0.05，P<0.01)。

與對照組比較：1)P<0.05圖3 UA對星形膠質細胞BACE活性的影響

3 討 論

研究顯示，高膽固醇飲食可以使AD動物模型腦內的Aβ聚集增多，長期服用大劑量他汀類藥物可改善臨床上輕中度AD患者的認知功能障礙〔8～10〕。目前研究膽固醇代謝與AD的關系已成為AD發病機制研究中的一個熱點。UA是膽固醇轉運抑制劑，尤其抑制膽固醇從溶酶體向細胞膜的轉運，從而使合成的膽固醇聚積在溶酶體中，引起膽固醇在核內體-溶酶體(EL)系統的再分布。膽固醇染色技術常用于細胞或組織中膽固醇的定位與定量觀察，目前常用的染色方法主要有Fillipin法、膽固醇氧化酶-DAB法及BC-θ毒素法。其中Fillipin是一種能結合膽固醇的熒光多烯抗生素，故能用來定位膽固醇在細胞內的位置。Fillipin染色法特異性強，操作簡單，圖像清晰，易于分辨和觀察。星形膠質細胞是膠質細胞的一種特殊形式，它可以幫助維持血腦屏障，向神經組織運輸營養，在大腦和脊髓修復中扮演重要角色。AD患者及轉基因動物腦中可見大量激活的星型膠質細胞，提示星形膠質細胞與AD的發生發展有密切關系〔11,12〕。本研究結果顯示，加入UA 后，星形膠質細胞內膽固醇呈現點狀蓄積。膽固醇局部濃度升高有利于BACE和γ-分泌酶發揮作用〔13,14〕。因此，調節膽固醇的分布能夠影響APP代謝，進而影響AD進程。

Aβ的生成過多和細胞外沉積是AD發病的主要病因。Aβ主要由APP經水解產生。APP 有兩條代謝途徑：一是經α-分泌酶水解，生成可溶性多肽sAPPα，由于切割位點在Aβ 序列內，不產生完整的Aβ 片段；另一條途徑是經BACE水解生成sAPPβ和C端跨膜片段β-CTF，β-CTF繼續被γ-分泌酶切割，釋放出Aβ1～40或Aβ1～42，此為APP代謝的經典途徑〔15〕。BACE的含量和活性大小直接決定了Aβ的生成。本研究結果顯示，UA明顯增強星形膠質細胞APP的表達。5 μg/ml UA 作用星形膠質細胞24 h 后對BACE1蛋白表達沒有影響，卻能明顯上調BACE的活性，增加Aβ1～42含量，提示UA可通過增加BACE的活性增強APP代謝。

綜上，UA引起星形膠質細胞膽固醇的聚積，促進了APP的表達，上調BACE活性，進而增強APP的代謝，促進Aβ的生成。