魚腥草素對體外培養大鼠成骨細胞增殖的影響

張朋朋 陳勇 郭江福 韓全勝 羅銳

(貴州省人民醫院急診外科，貴州 貴陽 550002)

目前老年骨質疏松尚無理想的根治方法，疾病治療的主要目標是延緩骨質疏松的發展速度。研究證實，氧化應激生成的活性氧會影響成骨細胞與破骨細胞，將破壞成骨與破骨細胞間的動態平衡，增加骨質疏松風險〔1〕。流行病學研究發現，骨質疏松患者機體抗氧化劑、氧化劑之間存在水平表達不平衡的情況，氧化劑水平明顯高于抗氧化劑水平〔2〕。激素替代療法是目前骨質疏松防治主要手段，但隨著激素替代療法的廣泛應用，其帶來的危害逐漸顯現，研究發現，英國在1993～2003年期間，>50歲女性經激素替代療法防治骨質疏松導致了至少2萬例乳腺癌的發生〔3〕，且該治療帶來的乳腺癌風險在國內也有相關概述〔4〕。可見激素替代應用的安全性有待商榷，還應繼續探討更為安全性的新治療方法。魚腥草素主要活性成分魚腥草素鈉化學結構穩定，可以抑制炎癥發生，還具有抑制動脈粥樣硬化血管中膜增厚等作用〔5〕。本研究探討魚腥草素對體外培養大鼠成骨細胞增殖的影響，旨在為骨質疏松的防治提供數據參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 貴州醫科大學動物實驗中心提供的雄性SD大鼠，體重200 g，日齡均≤3 d。

1.2實驗主要試劑 魚腥草素、Ⅱ型膠原酶、胰酶等均購自北京索萊寶科技；DMEM培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自四季青生物工程；購自賽業生物科技的成骨誘導分化培養基試劑盒，購自同仁化學研究所的細胞計數試劑盒(CCK)-8；購自南京建成生物的堿性磷酸酶試劑盒。

1.3主要儀器 上海點科學儀器提供pH測定儀(PHS-3C型)，OLYMPUS公司提供生物顯微鏡(BX51型)、倒置顯微鏡(IX71型)；北京白洋醫療器械提供醫用離心機(BY-320A型)；上海躍進醫用光學器械提供恒溫水溫箱(HH-W21-600BS型)，美國熱電公司提供全自動酶標儀(Thermo Multiskan Asccen型)；英國埃爾格公司提供超純水機(PURLABULTRA型)；美國Thermo公司提供二氧化碳培養箱(371型)，日本Sanyo提供超低溫冰箱，梅特勒托利多集團提供酸度計(PHSJ-3F型)、電子天平(AE240型)，Scotsman集團提供制冰機(AF100型)，美國Thwemolyne公司提供旋渦混合器。

1.4獲取并培養成骨細胞 麻醉后處死大鼠，無菌取顱骨，徹底剝除骨膜等主要軟組織，充分剪碎顱骨，緩沖液沖洗并加入適量的胰蛋白酶，消化后加入培養基(含胎牛血清)消化終止，去除消化液，向內加入膠原酶Ⅱ消化，時間為30 min，將消化液去除；向內再次加入膠原酶Ⅱ消化，時間為60 min，使用15 ml離心管，將消化液移至離心管內，離心處理后丟棄上清液，并向內加入適量胎牛血清，制作細胞懸液，移液器移入細胞懸液至培養瓶，在5%二氧化碳分壓、37℃、合理胞核濕度的條件下進行培養。培養期間換液，使用倒置顯微鏡對細胞生長情況仔細觀察。等到整個瓶底鋪滿細胞后吸出培養液，使用胰蛋白酶消化進行傳代培養。使用第三代細胞做實驗。使用成骨誘導液將魚腥草素配置為0、1、10、20、30、40 μmol/L 6種濃度培養液。

1.5CCK-8法測定細胞增殖 使用胰蛋白酶消化后第三代細胞，接種在96孔培養板內，100 μl/孔，分別向孔內加入濃度為0、1、10、20、30、40 μmol/L的魚腥草素+成骨細胞誘導液，在5%二氧化碳體積分數、37℃的條件下培養，并將未加入魚腥草素的第三代細胞作為空白對照，分別在第1、4、7、10天向每孔內加入10 μl CCK-8溶液，細胞培養板孵育，酶標儀測定吸光度。

1.6采用茜素紅染色法評價礦化結節情況 細胞接種方法不變，培養時間為15 d，參照文獻〔6〕中相關方法，使用茜素紅染色法評價不同魚腥草素濃度的礦化能力。2次去培養基磷酸鹽緩沖液沖洗，乙醇固定1 h后加入茜素紅S 40 mmol/L作用10 min，緩沖液洗滌3次，使用倒置顯微鏡觀察。后向內加入氧化十六烷基吡啶(CPC)孵育，時間為15 min，細胞基質釋放染料在562 nm波長下觀測吸光度定量。

1.7采用Western印跡法測定堿性磷酸酶(ALP)蛋白水平 以4×104/皿的密度將細胞接種在10 cm培養皿上，第10天時參照文獻〔7〕中體積方法提取蛋白。放射免疫沉淀(RIPA)裂解液裂解離心細胞后取上清液得到總蛋白，蛋白濃度試劑盒檢測后分離蛋白，采用濕轉法轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。封閉加入稀一抗-抗大鼠ALP抗體過夜。洗滌與稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗孵育60 min。再次洗滌，使用化學發光液與伯樂分子影響系統收集圖像并仔細分析。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶作為蛋白表達量內參。使用酶標儀檢測520 nm處吸光度，記錄數據后根據公式計算ALP蛋白活性。

1.8統計學方法 應用SPSS20.0統計學軟件進行單因素方差分析，LSD-t檢驗，χ2檢驗。

2 結 果

2.1細胞形態觀察 接種培養細胞4 h后貼壁，形態多為多角形、三角形或紡錘形，經24 h培養后可見細胞數量上升、體積增加、有交聯融合發生，如圖1；經7 d成骨誘導后，采用茜素紅染色發現小鈣化結節，如圖2。

圖1 大鼠干細胞接種培養24 h(×4)

圖2 大鼠干細胞成骨誘導培養第7天(茜素紅染色，×100)

2.2成骨細胞增殖抑制情況 魚腥草素作用2、7 d后，空白對照組、1、10、20、30、40 μmol/L組吸光度值隨著濃度增加均呈下降趨勢，各時點各組吸光度值比較差異有統計學意義(P<0.05)。即隨著魚腥草素濃度升高，成骨細胞增殖抑制作用增強，直至40 μmol/L濃度時成骨細胞增殖抑制作用有所緩解。見表1。

表1 各組體外培養不同時間大鼠成骨細胞增殖抑制作用吸光度值比較

與0 μmol/L比較：1)P<0.05；與1 μmol/L比較:2)P<0.05；與10 μmol/L比較:3)P<0.05；與20 μmol/L比較:4)P<0.05；與30 μmol/L比較:5)P<0.05；表2、3同

2.3礦化結節染色結果 成骨誘導培養7、14 d后，采用茜素紅染色結果顯示，10、20 μmol/L組礦化結節數多于其他各組，其他各組中40 μmol/L組培養各時點礦化結節數最少，其他濃度組培養7 d時，礦化結節數由少至多依次為空白對照組、1 μmol/L組、30 μmol/L組；培養14 d時依次為空白對照組、30 μmol/L組、1 μmol/L組，各組間礦化結節數比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組培養不同時間礦化結節數比較個/孔，n=16)

2.4ALP活性測定結果 在同一時間點，魚腥草素濃度為10～20 μmol/L時ALP活性最高，當濃度升高至30～40 μmol/L時有ALP活性抑制出現，隨培養時間延長ALP活性促進或抑制情況繼續增強，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組培養不同時間ALP活性測定結果比較吸光度/μg)

3 討 論

體外培養成骨細胞是研究成骨細胞功能與特性的重要工具，但因成骨細胞在礦化后有硬組織包裹，故取材相對困難〔8〕。目前，體外培養成骨細胞的各類技術已經逐漸成熟，包括原代細胞培養、骨組織培養等，其他間質干細胞分離提取誘導的方法也有使用，但這些體外培養成骨細胞的方法均有局限性，如骨細胞數量不夠、骨細胞純度低下、骨細胞活性低下等〔9，10〕。本研究中將大鼠顱骨粉碎并經酶消化，將消化液與未完全消化骨片共同培養，分離提取原代成骨細胞，該體外培養大鼠成骨細胞的方法，較其他成骨細胞提取技術更具優勢，其步驟相對簡單，培養細胞的活性更強，純度也更高，用于臨床實驗研究更具價值〔11〕。

成骨細胞及破骨細胞二者在功能方面存在動態平衡關系，二者之間平衡關系是保證并維持骨組織正常的基礎，一旦二者之間的平衡關系被破壞，成骨細胞凋亡速度將明顯加快，短時間內成骨細胞數量將大大減少，此時破骨細胞凋亡受抑制，增加骨質疏松風險〔12～14〕。此外，骨質疏松的發展還與機體免疫系統緊密相關，免疫系統受到外界不良刺激后異常激活，免疫系統的異常激活會對成骨細胞及破骨細胞產生影響，使得二者動態平衡打破；此外，免疫系統在發生異常后，還會產生各種細胞因子，這些細胞因子將通過各自對應的信號通路與對應受體相結合，對成骨細胞與破骨細胞之間的平衡產生影響，最終誘發骨質疏松〔15，16〕。目前，可以用于骨質疏松治療且很好改善患者成骨細胞與破骨細胞平衡的藥物并不多見，多數藥物的使用僅僅只能延緩患者疾病進程，在治療上均無法達到預期。故為骨質疏松患者成骨細胞與破骨細胞之間功能不平衡狀態找到一個新的治療靶點與方向一直是臨床研究的難點。魚腥草素又名癸酰乙醛，是三百草科植物蕺菜揮發油主要抗菌成分，是一種具有揮發性氣味的芳香油，在臨床上多用于免疫系統相關疾病的治療，對諸多菌種有著理想的抑制作用，可增強機體白細胞吞噬能力，調動機體免疫力〔17〕。朱善元等〔18〕在研究中發現，魚腥草素的使用能夠刺激淋巴細胞增殖能力，對動物免疫功能的影響好。

考慮成骨細胞與破骨細胞間功能不平衡可能與機體免疫系統有關，本研究將不同濃度的魚腥草素用于體外培養成骨細胞增殖的誘導，結果顯示，魚腥草素可能具有抑制骨吸收、抑制破骨細胞活性增強、抑制成骨細胞凋亡等功效，可以考慮將其作為未來骨質疏松治療藥物研究的新靶點。因本研究只是研究魚腥草素對成骨細胞功能影響及受體表達具體情況，加之無循證學依據作為理論支持，故還需要繼續研究魚腥草素具體的作用機制及信號通路，其是否對機體骨骼系統有影響還需要進一步行體內實驗。