鄰苯三酚自氧化法對茶葉中茶多酚的抗氧化性能應用研究

陳仕學，姚元勇，盧忠英，汪蘭，秦馨

（銅仁學院材料與化學工程學院，貴州銅仁554300）

茶作為當今世界上最為普及的功能性飲料，具有各種保健功效，從而引起人們的廣泛關注。茶葉含有多種人體必須的有效成分，主要為咖啡堿、茶多酚（tea polyphones，TP）、氨基酸等，其中茶多酚約占茶葉干重15%～30%。茶多酚是茶葉中最重要的保健成分之一。茶多酚作為一種新型的天然抗氧化劑，具有消除體內產生的自由基、抗癌、抗氧化等功效。2015年，高媛圓等[1-3]研究證明：茶多酚對老年癡呆、糖尿病和乳腺癌具有防治和抑制作用；2019年，張勁等[4]對茶葉中的茶多酚功能進行研究，表明茶多酚具有抗氧化、降血脂、降血糖、清除人體自由基等功能，發現其對人的身體無毒副作用，且茶葉中的茶多酚含量是其他植物所無法相比的[5]，因此在化工、食品、醫藥、護膚品等行業具有廣闊的應用前景和開發價值[6-8]。

目前，國內外許多研究者對茶葉中茶多酚的抗氧化作用都作了一定的文獻報道，認為茶多酚之所以具有抗氧化能力，是因為茶多酚中的主要成分兒茶素具有供氫功能的酚羥基[9]，如王媛等報道：茶多酚具備優良的氫供體，因而能與體內過量的自由基作用，形成比較穩定的酚氧自由基，從而避免生物體遭受過量自由基造成的氧化損傷[10-11]；程德竹等[12]運用紫外可見光分光光度法定量測定茶葉中茶多酚，通過加入茶多酚對鄰苯三酚自氧化產生的超氧自由基的清除作用來評價茶葉中茶多酚抗氧化能力。但是由于不同測試體系的測試方法與其條件相差比較大，將對試驗結果產生較大影響。

為了使試驗更加準確可靠，本文首先要確定鄰苯三酚自氧化反應條件，即鄰苯三酚在堿性環境中自氧化的測定波長、反應時間、反應速率。在此條件下，測定不同類型茶葉中茶多酚對鄰苯三酚自氧化反應產生超氧自由基的清除能力，從而評價不同類型茶葉抗氧化能力的強弱。目前，關于銅仁地區不同類型茶葉中茶多酚的提取有相關報道[13-14]，但對其本地的茶葉中茶多酚抗氧化能力研究未見報道。因此，本文梵凈山綠茶、梵凈山小醬白茶、銅仁苦丁茶、石阡苔茶（紅茶）為原料，采用鄰苯三酚自氧化體系來評價不同類型茶葉的抗氧化能力，以期對開展茶葉的綜合利用提供一定的參考依據。

1 材料、試劑與儀器

1.1 試驗材料

梵凈山綠茶、梵凈山小醬白茶、銅仁苦丁茶、石阡苔茶（紅茶）：貴州芳瑞堂生物科技有限公司。

1.2 試驗試劑

鄰苯三酚：阿拉丁化學試劑網；磷酸鹽（phosphate beffered soiution，PBS）緩沖液：博士德生物工程有限公司；鹽酸：成都金山化學試劑有限公司；氫氧化鈉：天津市恒興化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.3 試驗儀器

HHS數顯式電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實業有限公司；100 μL～1 000 μL 移液槍：上海漢林有限公司；MP電子分析天平：上海恒平科學儀器有限公司；C-30玻璃儀器氣流烘干器：鄭州長城科貿有限公司；759S紫外可見分光光度計：上海棱光技術有限公司。

2 試驗方法

2.1 鄰苯三酚自氧化反應條件確定

2.1.1 檢測波長的確定

精密量取5mL（pH=8.0）PBS緩沖溶液與0.1 mL（0.4 mg/mL）鄰苯三酚溶液于10mL容量瓶中，用蒸餾水定容至10 mL。反應5 min后，以（pH=8.0）PBS緩沖液做空白對照，進行紫外光譜掃描，確定吸收峰波長。

2.1.2 反應時間與反應速率的確定

在檢測波長確定下，每隔5 min進行1次紫外光譜掃描，共掃描50 min，然后以吸光值A對反應時間作線性關系圖。挑選出線性關系最好的一段，其所經歷的時間即為反應時間t，其方程的斜率為鄰苯三酚自氧化速率V0，從而確定鄰苯三酚自氧化反應時間與反應速率。

2.2 茶多酚的抗氧化試驗研究

2.2.1 不同類型不同質量濃度茶葉中茶多酚對超氧自由基的清除

精密量取0.1 mL（0.4 mg/mL）鄰苯三酚溶液和5 mL（pH=8.0）PBS緩沖液、分別加入不同濃度（0.04、0.06、0.08、0.12、0.14 mg/mL）的梵凈山綠茶溶液 1 mL，置于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至10 mL，反應5 min后，以（pH=8.0）PBS緩沖溶液做空白對照，在320 nm波長處，每隔5 min測定1次吸光值[15]，共反應25 min；同法分別加入不同濃度（0.06、0.08、0.1、0.14、0.16 mg/mL）梵凈山小醬白茶茶多酚溶液、不同濃度（0.1、0.12、0.14、0.16、0.18 mg/mL）石阡苔茶紅茶茶多酚溶液、不同濃度（0.08、0.1、0.12、0.14、0.16 mg/mL）銅仁苦丁茶茶多酚溶液，從而比較不同類型不同濃度茶多酚的超氧自由基清除作用，以吸光值A對反應時間t作線性關系圖，斜率記作V1，代入式（1），計算出不同質量濃度下的茶多酚對超氧自由基的清除率Y。

式中：Y為清除率；V1為鄰苯三酚自氧化后加入樣品檢測吸收值；V0為鄰苯三酚自氧化后檢測吸收值。

2.2.2 不同類型茶葉中茶多酚對自由基的清除率與質量濃度線性關系

根據上述2.2.1的計算結果，以不同類型茶葉中茶多酚的質量濃度為橫坐標，超氧自由基的清除率為縱坐標作圖，得出茶葉中茶多酚對自由基的清除率與質量濃度的線性方程，根據方程可算出當清除率為50%時的茶多酚質量濃度（IC50）值，IC50值可以作為衡量抗氧化物清除超氧自由基能力的一個指標，其值越小，說明清除自由基能力越強[16]。通過比較不同類型茶葉中茶多酚的IC50大小，從而評價不同類型茶葉的抗氧化能力。

3 結果與分析

3.1 鄰苯三酚自氧化反應測定波長

根據2.1.1的操作，其結果見圖1。

圖1 鄰苯三酚自氧化吸收波長掃描圖Fig.1 Scanning image of catechol self-oxidation absorption wavelength

由圖1可得，鄰苯三酚法的原理為，鄰苯三酚在堿性環境下會發生自氧化，產生超氧自由基，加入抗氧化劑后超氧自由基與其反應，超氧自由基的量減少，吸收峰降低。由此可知，鄰苯三酚在堿性環境下發生自氧化時，在320 nm處出現最大吸收峰，故選擇320 nm作為鄰苯三酚自氧化的測定波長。

3.2 鄰苯三酚自氧化反應時間確定

根據2.1.2的操作，結果見圖2。

從圖2可以看出：隨著時間推進，反應體系在320 nm下吸光值逐漸增加，從35 min開始，其每分種的吸光度值的增量開始逐漸減小，到達50 min時，吸光度值趨于平衡，因而整個反應過程的吸光度值A和反應t的線性關系較差。而在前25 min的反應時間內，數據點均勻分布在趨勢線兩邊，其線性關系較好，故鄰苯三酚自氧化反應時間為25 min。

圖2 鄰苯三酚體系自氧化反應時間Fig.2 Autooxidation time of pyrogallol system

3.3 鄰苯三酚自氧化反應體系速率的確定

根據2.1.2的操作，其結果見圖3。

圖3 鄰苯三酚自氧化反應體系速率Fig.3 Rate of pyrogallol autooxidation reactionsystem

根據圖3，在25 min內，吸光值A對反應時間的線性關系良好，其方程斜率為鄰苯三酚自氧化速率V0（0.006 2），相關系數可以達到0.999 7，而且每一段時間間隔內，有色中間產物（半醌）都以穩定的增量增加，且反應速率趨于穩定，故確定該反應速率V0為0.006 2。

3.4 茶葉中不同類型不同質量濃度的茶多酚對超氧自由基的清除

3.4.1 綠茶中不同質量濃度的茶多酚對超氧自由基的清除作用

根據2.2.1的操作，結果見圖4。

根據圖4中的線性方程斜率代入（1）式，可計算出不同質量濃度的梵凈山綠茶茶多酚對超氧自由基的清除率，分別為：Y0.04=29.03%、Y0.06=41.94%、Y0.08=50%和Y0.12=70.96%、Y0.14=92.00%。由此可知，隨著綠茶茶多酚質量濃度的增加，其所含的茶多酚含量也增加，對超氧自由基的清除能力也越來越強。

圖4 綠茶中不同質量濃度的茶多酚的反應體系吸光值與時間線性關系Fig.4 Linear relation diagram of absorbance value and time in reaction system of green tea polyphenols with different mass concentrations

3.4.2 綠茶茶多酚對超氧自由基的清除率與質量濃度線性關系

別呦呦別過頭，朝司大愣子抿嘴一笑。司大愣子心里直癢癢，但媳婦的話是圣旨，他不敢違抗，只好戀戀不舍地走了。

根據2.2.2的操作，結果見圖5。

圖5 超氧自由基清除率與綠茶茶多酚質量濃度線性關系Fig.5 Linear relationship between the scavenging rate of superoxide anion free radicals and the mass concentration of green tea polyphenols

由圖5線性方程可知，相關系數R2=0.979 8，數據點分布在趨勢線兩邊，線性關系良好，根據該圖線性擬合所得曲線的線性關系式Y=5.940 3X+0.045 1，當清除率為50%時（將Y=50%代入線性方程）計算綠茶茶多酚質量濃度（X值），即為IC50值為0.080 mg/mL。且綠茶茶多酚質量濃度與超氧自由基清除率呈正相關，隨著綠茶茶多酚質量濃度的增加，對超氧自由基的清除能力也越來越強。

3.4.3 白茶茶多酚對超氧自由基的清除作用

根據2.2.1的操作，結果見圖6。

根據圖6中的線性方程斜率代入（1）式，計算不同質量濃度的梵凈山小醬白茶茶多酚對超氧自由基的清除率為分別為：Y0.06=27.42%、Y0.08=38.71%、Y0.1=51.61%和Y0.14=69.35%、Y0.16=93.55%。由此可知，隨著白茶茶多酚濃度的增加，其所含的茶多酚含量也增加，對超氧自由基的清除能力也越來越強。

圖6 不同質量濃度的白茶茶多酚中反應體系吸光值與時間線性關系Fig.6 Linear relation diagram of absorbance value and time in reaction system of white tea polyphenols with different mass concentrations

3.4.4 白茶茶多酚對超氧自由基的清除率與質量濃度線性關系

根據2.2.2的操作，結果見圖7。

由圖7的線性方程可知，相關系數R2=0.973 6，數據點分布在趨勢線兩邊，線性關系良好，根據該圖線性擬合所得曲線的線性關系式Y=6.207 7X-0.109 1，當清除率為50%時（將Y=50%代入線性方程），得梵凈山小醬白茶茶多酚的IC50為0.098 mg/mL。其值大于3.4.2梵凈山綠茶中茶多酚的IC50=0.080 mg/mL，從而得出綠茶的抗氧化能力大于白茶。然而，茶葉中具有抗氧化能力的物質主要是茶多酚，其茶多酚含量的多少可直接影響茶葉抗氧化能力的強弱，由制作工藝可知，綠茶屬于未發酵茶，白茶經過輕微的發酵處理，其茶多酚含量會有一定程度的損失。從而導致抗氧能力小于綠茶。

圖7 超氧自由基清除率與白茶茶多酚質量濃度線性關系Fig.7 Linear relationship between superoxide free radical scavenging rate and white tea polyphenol mass concentration

3.4.5 紅茶茶多酚對超氧自由基的清除作用

根據2.2.1的操作，結果見圖8。

圖8 不同質量濃度的紅茶茶多酚中反應體系吸光值與時間線性關系Fig.8 Linear relation diagram of absorbance value and time in reaction system of black tea polyphenols with different mass concentrations

根據圖8中的線性方程斜率代入（1）式，計算不同質量濃度的石阡苔茶（紅茶）茶多酚對超氧自由基的清除率為分別為：Y0.1=20.97%、Y0.12=33.87%、Y0.14=46.76%和Y0.16=74.19%、Y0.18=90.32%，由此可知，隨著紅茶茶多酚濃度的增加，其所含的茶多酚含量也增加，對超氧自由基的清除能力也越來越強。

3.4.6 紅茶茶多酚對超氧自由基的清除率與質量濃度線性關系

根據2.2.2的操作，結果見圖9。

由圖9的線性方程可知，相關系數R2=0.979 4，數據點分布在趨勢線兩邊，線性關系良好，根據該圖線性擬合所得曲線的線性關系式Y=8.951X-0.720 9，當清除率為50%時（將Y=50%代入線性方程），得石阡苔茶（紅茶）茶多酚的IC50為0.136 mg/mL。其值大于3.4.2梵凈山綠茶中茶多酚的IC50=0.080 mg/mL，從而得出綠茶的抗氧化能力遠大于紅茶，這是因為茶葉中抗氧化能力主要成分是茶多酚，其茶多酚含量多少可直接影響茶葉抗氧化能力的強弱，由制作工藝可知，紅茶屬于全發酵茶，紅茶在制作過程中經過深度發酵處理，其茶葉中茶多酚含量損失比較大，從而導致紅茶抗氧能力遠小于綠茶。

圖9 超氧自由基清除率與紅茶茶多酚質量濃度線性關系Fig.9 Linear superoxide free rate and mass of black tea polyphenols

3.4.7 苦丁茶茶多酚對超氧自由基的清除作用

根據2.2.1的操作，結果見圖10。

根據圖10中的線性方程斜率代入（1）式，計算不同質量濃度的銅仁苦丁茶茶多酚對超氧自由基的清除率為分別為：Y0.08=20.97%、Y0.1=33.87%、Y0.12=48.39%和Y0.14=66.13%、Y0.16=85.48%。由此可知，隨著苦丁茶茶多酚濃度的增加，其所含的茶多酚含量也增加，對超氧自由基的清除能力也越來越強。

3.4.8 苦丁茶茶多酚對超氧自由基的清除率與質量濃度線性關系

根據2.2.2的操作，結果見圖11。

圖10 不同質量濃度的苦丁茶茶多酚中反應體系吸光值與時間線性關系Fig.10 Linear relation diagram of absorbance value and time in reaction system of broadleaf holly leaf polyphenols with different mass concentrations

圖11 超氧自由基清除率與苦丁茶茶多酚質量濃度線性關系Fig.11 Linear relationship between superoxide anion radical scavenging rate and the mass concentration of broadleaf holly leaf polyphenols

由圖11的線性方程可知，相關系數R2=0.992 9，數據點分布在趨勢線兩邊，線性關系良好，根據該圖線性擬合所得曲線的線性關系式Y=8.064ⅹ-0.458，當清除率為50%時（將Y=50%代入線性方程），得到銅仁苦丁茶茶多酚的IC50為0.119 mg/mL。其值大于3.4.2梵凈山綠茶中茶多酚的IC50=0.080 mg/mL，從而得出綠茶的抗氧化能力大于苦丁茶，茶葉中抗氧化能力主要成分是茶多酚，苦丁茶的制作工藝與綠茶相似，都是未經過發酵處理，屬于未發酵茶，但由于苦丁茶含有大量的多糖、黃酮、皂苷、熊果酸、咖啡堿、氨基酸、維生素、揮發油等200多種成分[17]，提取過程產生的雜質較多，對其中的茶多酚含量有一定程度影響。所以，苦丁茶的抗氧化能力小于綠茶。

4 結論

根據試驗建立鄰苯三酚自氧化模型，其條件為：鄰苯三酚自氧化的檢測波長為320nm、濃度為0.4mg/mL、PBS緩沖液pH=8.0、V（鄰苯三酚溶液）：V（PBS緩沖液）=0.1∶5、反應時間25 min，測得4種不同類型茶葉中[梵凈山綠茶、梵凈山小醬白茶、銅仁苦丁茶、石阡苔茶（紅茶））茶多酚清除超氧自由基能力的IC50分別為：0.08、0.098、0.119、0.136 mg/mL，即 4 種類型茶葉抗氧化能力依次為：梵凈山綠茶>梵凈山小醬白茶>銅仁苦丁茶>石阡苔茶（紅茶）。由于茶葉中主要的抗氧化活性物質是茶多酚，茶葉的發酵程度不同，抗氧化活性物質茶多酚含量也存在較大差異[18]。即茶葉中的茶多酚含量的大小直接影響茶葉的抗氧化能力，梵凈山綠茶為不發酵茶，保留了茶葉中原有的天然物質，其所含的茶多酚含量會比其他類型茶葉茶多酚含量高很多。因此，綠茶的抗氧化能力最強；梵凈山小醬白茶為微發酵茶，經過輕微的發酵工藝處理，所含的茶多酚會有一定程度的損失，使抗氧化能力降低；紅茶為全發酵茶，在發酵過程中發生了化學反應，產生新的化學物質，茶多酚含量會有很大程度的損失，其抗氧化能力有很大程度減弱；苦丁茶制作工藝和綠茶相似，但由于含有大量的多酚，多糖、黃酮、皂苷、熊果酸、咖啡堿、氨基酸、維生素、揮發油等200多種成分，對其中的茶多酚含量有一定程度影響。從而影響苦丁茶中茶多酚的抗氧化能力，由此可知，茶葉的制作工藝不同，其主要成分茶多酚的抗氧化能力不同，這為后續的應用研究提供一定的參考依據。