響應面法優化女貞子原花青素提取工藝及抗氧化研究

郗艷麗，周旋，霍明洋，高銳，馬一芯，楊闊，徐斌，*

（1.吉林醫藥學院 公共衛生學院，吉林吉林132013；2.吉林醫藥學院 臨床醫學院，吉林吉林132013）

%女貞子原產于長江流域，主要在華南、河南、陜西、甘肅等地種植。后來被引入北方[1]。目前女貞子在氣候適宜的地區均有種植，資源非常豐富。女貞子有滋補肝腎、養陰、止血的功效[2]。臨床上常用于治療肝腎陰虛、頭暈、耳鳴、咽喉干燥、腰膝酸痛、月經過多[3-4]。女貞子表皮呈黑褐色或黑紫色，這些黑褐色或黑紫色物質中富含原花青素。原花青素是一類多酚化合物的統稱，主要存在于植物的花、果實、種子及外皮中[5]，其中葡萄籽和松樹皮中原花青素的含量極高[6]。原花青素在抗氧化方面具有無可比擬的優勢，能有效清除機體內的自由基[7]，其清除自由基的能力是維生素E的50倍，Vc的20倍[8]，有明顯的抗菌、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、保護血管、增強機體免疫力、增強機體抗輻射能力等功能[9-11]。

目前，從植物中分離原花青素的方法主要有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法、酶輔助提取法等[12]。傳統的溶劑提取法雖能獲得原花青素，但存在提取率較低、溶劑消耗量大、提取時間較長等不足之處。超聲輔助提取法作為提取植物活性物質的新技術不僅具有操作簡單、安全、節能、高效等優點，而且具有提取時間短、無需加熱的特點，可有效減少原花青素等熱敏物質在提取時的結構改變。近年來女貞子黃酮、多糖提取物抗氧化活性方面研究較多[13-14]，但女貞子原花青素抗氧化活性方面研究鮮見報道。因此，本研究以女貞子原花青素含量為評價指標，采用Box-Behnken設計-響應曲面法優化提取工藝，并分析女貞子原花青素對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除作用，評價本研究方法提取的原花青素的生物活性，為女貞子的研究、開發和利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

女貞子：吉林市某藥房，產地為湖南；原花青素（生產批號：B21615）：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇：天津市永大化學試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：Sigma公司；維生素C（Vc）：上海生工有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BS224S電子天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；722型可見光分光光度計：上海菁華科技有限公司；KQ-800KDE高功率超聲波清洗器：昆山舒美公司；EV311旋轉蒸發儀：北京萊伯泰科公司。

1.3 女貞子原花青素的提取工藝流程

取女貞子藥材適量，粉碎后過60目篩。稱取女貞子粉末1.0 g，置于燒杯中，加入一定體積分數的乙醇溶劑超聲輔助提取，冷卻后5 000 r/min離心20 min，取上清，移入60 mL容量瓶中，用乙醇定容至60 mL，獲得原花青素粗提液。

1.4 女貞子原花青素的含量測定

1.4.1 原花青素標準品溶液的制備

精密稱取原花青素標準品10 mg，置于10 mL容量瓶中，加適量50%乙醇超聲（頻率：50 kHz，功率：500 W）充分溶解，冷卻后以50%乙醇補足至刻度，搖勻，得質量濃度為1.0 mg/mL的原花青素標準品溶液。

1.4.2 最大吸收峰的確定

精密吸取原花青素標準品溶液和樣品提取液各1.0mL，以50%乙醇調零，用紫外分光光度計在200nm～600 nm波長范圍內進行全波長掃描，記錄掃描圖譜并對比掃描圖譜。

1.4.3 標準曲線的繪制

精密量取1.0 mg/mL的原花青素溶液0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mL，加入 50%乙醇至 1.0 mL，分別加入體積比為95∶5的正丁醇-鹽酸溶液6.0 mL和2%硫酸高鐵銨溶液0.2 mL，搖勻并定容至10 mL，沸水浴加熱40 min，顯色后立即使用冰水冷卻，550 nm處比色測定，用同等體積的50%乙醇代替標準品作為空白對照，繪制原花青素的標準曲線，得回歸方程為y=0.855 1x-0.001 5（x為原花青素標準品濃度，mg/mL；y為吸光度值），R2=0.999 2。

1.4.4 女貞子粗提液中原花青素提取率的計算

精確稱取1.0 g女貞子粉末，按1.3方法進行提取，按照1.4.3的方法顯色，用同等體積的50%乙醇代替標準品作為對照，將測定吸光度值帶入標準曲線，求得粗提液樣品中原花青素的質量濃度，代入下列公式求得女貞子中原花青素提取率。

式中：ρ為粗提液樣品中原花青素的質量濃度，mg/mL；V為粗提液定容后的體積，mL；N為稀釋倍數；m為女貞子的質量，g。

1.5 單因素試驗設計

對女貞子中原花青素提取條件所涉及到的4個因素（液料比、提取時間、超聲功率和乙醇體積分數）進行了考察，每個因素選取3個水平進行正交試驗優化，得出最佳提取條件。1）液料比設定為 10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1（mL/g）；2）提取時間設定為 10、20、30、40、50、60 min；3）超聲功率設定為 320、400、480、540、640、720 W；4）乙醇體積分數設定為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%。

1.6 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，依據Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behenken試驗設計原理，以女貞子提取液中原花青素提取率為響應值，以提取時間、超聲功率、乙醇體積分數和液料比為因變量進行四因素三水平的響應面分析試驗（見表1），優化超聲波輔助提取女貞子原花青素工藝參數。

表1 響應面試驗設計因素水平表Table 1 Design of factors and levels of response surface test

1.7 原花青素抗氧化試驗

1.7.1 女貞子原花青素粗提物對DPPH自由基的清除作用

參照Vattem等[15]的方法并稍作修改。精密稱取DPPH試劑4.5 mg，加無水乙醇溶解，棕色容量瓶定容至100 mL，濃度為0.08 mol/L，避光保存備用。分別取濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L 和 1.0 mg/L 的樣品溶液1.0 mL，置于10 mL試管中，加入2.0 mL的DPPH溶液，30℃、避光反應40 min后，517 nm測定吸光度值，計算DPPH自由基的清除率，VC作為陽性對照。

式中：A1為1.0 mL樣品溶液+2.0 mL DPPH溶液的吸光度值；A2為1.0 mL樣品溶液+2.0 mL蒸餾水的吸光度值；A3為1.0 mL蒸餾水+2.0 mL DPPH溶液的吸光度值。

1.7.2 女貞子原花青素粗提物對·OH的清除作用

參照尤小梅等[16]和張鏡等[17]的方法并稍作修改，在比色管中依次加入濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L和1.0 mg/L的女貞子原花青素粗提物溶液，再加入1.0 mL 9 mmol/L的硫酸亞鐵、1.0 mL 9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液、1.0 mL 8.8 mmol/L的過氧化氫溶液。經37℃水浴反應0.5 h后，以蒸餾水作為參比，于510 nm下測定吸光度。按公式計算對·OH的清除率：

式中：A1為不加女貞子原花青素粗提物溶液的空白對照液的吸光度；A2為加入女貞子原花青素粗提物溶液后的吸光度；A3為無顯色劑時提取劑本底吸光度。

1.7.3 女貞子原花青素粗提物對O2-·的清除作用

參照徐懷德等[18]的方法并稍作修改，女貞子原花青素粗提物對O2-·的清除作用采用鄰苯三酚自氧化法進行測定，取 4.5 mL、pH 8.2、50 mmol/L 的 Tris-HCl緩沖液，4.2mL超純水，混勻后25℃保溫30min。加入25℃預熱的3 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL（以10 mmol/L HCl配制）和1.0 mL超純水，于325 nm下每隔30 s測定吸光度值，計算線性范圍內每分鐘吸光度的增加。空白管用等體積蒸餾水代替樣品溶液，用10 mmol/L的HCl代替鄰苯三酚溶液。樣品活性測定：在加入鄰苯三酚前，分別加入為濃度為 0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L 和 1.0 mg/L的原花青素粗提物溶液1.0 mL，然后按鄰苯三酚自氧化法測定的方法操作，按公式計算清除率：

式中：A0為鄰苯三酚自氧化速率吸光度值；A1為加入原花青素樣品后的鄰苯三酚自氧化速率吸光度值。

1.8 數據處理

采用Excel 2010軟件作圖，應用Design-Expert 8.0.6軟件，分別對單因素試驗數據和響應面數據進行分析處理，回執單因素變化趨勢圖、建立線性回歸方程并判斷模型顯著性。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

原花青素在不同波長下的吸光度見圖1。通過研究發現原花青素提取液與標準品溶液在550 nm處有共同最大吸收峰。

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取時間對原花青素提取率的影響

圖1 原花青素在不同波長下的吸光度Fig.1 Absorbance of proanthocyanidins at different wavelengths

提取時間對原花青素的提取率有很大影響。提取時間不足會造成提取不充分；提取時間太長，原花青素可能會降解，造成提取率下降，原花青素的生物活性也可能會因為提取時間太長而降低[19]。提取時間對原花青素提取率的影響見圖2。

提取時間在30 min時，原花青素的提取率達到最大值，為（1.93±0.13）%。在提取時間為 10 min～20 min之間，提取率不高，可能與提取時間不足有關。提取時間不夠，超聲的作用沒能發揮最大作用，當提取時間超過30 min以后，原花青素提取率略有下降，這可能與提取時間太長有關，提取時間太長，提取的原花青素發生降解而被破壞。所以提取時間暫定為30 min。

圖2 提取時間對原花青素提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of proanthocyanidins

2.2.2 超聲功率對原花青素提取率的影響

超聲的空化作用能使細胞碎裂，且超聲具有攪拌和振蕩作用，有利于液料的充分接觸，促進胞內有效成分溶出[20]。但當超聲功率增大到一定程度，會造成液體出現空化泡，減少能量傳遞，不利于原花青素的提取[21]。超聲功率對原花青素提取率的影響見圖3。

圖3 超聲功率對原花青素提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of proanthocyanidins

超聲功率在350W～400 W范圍內，原花青素提取率隨超聲波功率的增大而上升，在400 W處達到最大值，提取率為（2.82±0.42）%。當超聲功率達到400 W以后，提取率呈下降趨勢。故選擇超聲功率400 W為最佳提取條件。

2.2.3 液料比對原花青素提取率的影響

溶劑和原料在形成合適的比例時，有利于原花青素的溶出，提取率達到最高。溶劑與原料的比值增大，雖然有利于原花青素的浸出，但溶劑使用量過大，不僅會造成浪費，還會給超聲作用帶來阻力，不利于原花青素的提取。液料比對女貞子原花青素提取率的影響見圖4。

圖4 液料比對原花青素提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of proanthocyanidins

當液料比為30∶1（mL/g）時，女貞子原花青素提取率達到最大值，為（2.18±0.19）%。當液料比從30∶1（mL/g）增加到 60 ∶1（mL/g），原花青素提取率略有降低。從節能環保角度出發，選擇30∶1（mL/g）為最佳液料比。

2.2.4 乙醇體積分數對原花青素提取率的影響

乙醇體積分數對原花青素提取率的影響見圖5。

圖5 乙醇體積分數對原花青素提取率的影響Fig.5 Effect of f ethanol concentration on the yield of proanthocyanidins

圖5結果顯示，隨著乙醇濃度不斷增大，原花青素提取率持續增加，可能與乙醇能促進氫鍵斷裂有關。乙醇作用后能形成小分子的原花青素，從而使溶液中的原花青素提取率升高。當乙醇濃度為40%時，原花青素提取率最高，達到（2.50±0.39）%。當乙醇濃度高于40%，原花青素提取率逐漸下降，這可能與原花青素的極性較強有關，乙醇濃度太高會造成溶液極性弱，水溶性原花青素析出反而會減少有關。故選定40%的乙醇體積分數為最佳提取條件。

2.3 響應面試驗

2.3.1 模型方程建立與顯著性檢驗

Box-Behnken試驗設計與結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

通過Design Expert 8.0.6軟件進行多元回歸分析，得到回歸方程為Y=2.786+0.076A-0.066B+0.478C+0.068D+0.138AB-0.348AC+0.198AD-0.573BC-0.083BD-0.248CD-0.586A2-0.303B2-0.638C2-0.021D2。方差分析表見表3。

由表3可知，女貞子原花青素提取模型的P<0.05，表明該回歸模型是有效可靠的，達到了極顯著水平（P<0.001），用該模型對女貞子原花青素的提取工藝進行試驗分析是合理的。該模型失擬項的P值為0.407 5>0.05，不顯著，對模型有利。相關系數R2=0.8898，該模型能解釋88.98%響應值的變化，校正系數R2Adj=0.779 6，變異系數值為11.54，說明該模型的可行度較好，可以用來分析女貞子原花青素的提取率。根據表3中F值的大小，推測影響本次試驗提取率大小的因素為提取時間（A）>乙醇體積分數（D）>超聲功率（B）>液料比（C）。從表3中可以看出，二次項BC、A2、B2和C2對響應值的影響極顯著（P<0.01）。

表3 方差分析表Table 3 The table of variance analysis

2.3.2 響應面分析

圖6為影響女貞子原花青素提取率的各因素交互作用的響應面圖。從響應面分析圖可看出最佳參數及各參數之間的相互作用。

等高線的形狀可反映出交互效應的強弱，馬鞍形或者橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則表示不顯著。由圖6知，響應面順著提取時間的方向陂度最大，結合方差分析，可以得到提取溫度在交互作用中對女貞子原花青素提取率的影響最顯著，乙醇體積分數與超聲功率的影響次之，液料比的影響作用不顯著。

由Design-Expert 8.06軟件分析得出：在穩定狀態下女貞子原花青素的提取率最大值為2.90%，此時的提取條件為提取時間33.32 min，超聲功率408.48 W，液料比27.03∶1（mL/g），乙醇濃度50%。理論預測女貞子原花青素的提取率為2.90%。以實際操作的方便考慮，將提取條件修正為提取時間33 min，超聲功率400 W，液料比 27∶1（mL/g），乙醇濃度 50%。

圖6 各自變量間交互作用對女貞子原花青素提取率的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of independent variable interaction effect to extraction yield of proanthocyanidins from Ligustrum lucidum ait

2.4 驗證試驗

根據優化的提取工藝，進行3次驗證試驗，結果女貞子原花青素的提取率分別為2.91%、2.79%和2.85%，女貞子原花青素提取率的平均值為（2.85±0.06）%，相對標準偏差為0.28%，與預測相對誤差為0.18%，表明該優化方案穩定可靠，具有實用價值。

2.5 原花青素抗氧化試驗

2.5.1 女貞子原花青素粗提物對DPPH自由基的清除作用

女貞子原花青素粗提物對DPPH自由基的清除作用見圖7。

圖7 女貞子原花青素粗提物對DPPH自由基的清除作用Fig.7 The effect of proanthocyanidins from the Ligustrum lucidum ait on DPPH radical

由圖7可知，女貞子原花青素提取物對DPPH自由基有較好的清除作用。隨著女貞子原花青素提取物濃度的增加，其對DPPH自由基的清除率逐漸升高。女貞子原花青素提取物的濃度與DPPH自由基的清除率呈依賴性。女貞子原花青素提取物對DPPH自由基的清除效果顯著高于陽性對照物VC。

圖8 女貞子原花青素粗提物對·OH自由基的清除作用Fig.8 The effect of proanthocyanidins from the Ligustrum lucidum ait on hydroxyl radical

2.5.2 女貞子原花青素粗提物對·OH的清除作用

女貞子原花青素粗提物對·OH的清除作用見圖8。

由圖8可知，女貞子原花青素提取物對·OH有較好的清除作用。女貞子原花青素提取物的濃度與·OH的清除率呈依賴關系。女貞子原花青素對·OH的清除效果顯著高于陽性對照VC。當女貞子原花青素提取物和VC的濃度增從0.6 mg/mL增加到1.2 mg/mL時，此時其對·OH的清除率已接近飽和狀態，因而自由基的清除率變化不顯著。

2.5.3 女貞子原花青素粗提物對O2-·自由基的清除作用

女貞子原花青素粗提物對O2-·自由基的清除作用見圖9。

由圖9可知，女貞子原花青素提取物對O2-·有較好的清除作用。女貞子原花青素提取物的濃度與O2-·的清除率呈依賴關系。女貞子原花青素對O2-·的清除效果顯著高于陽性對照VC。

圖9 女貞子原花青素粗提物對O2-·自由基的清除作用Fig.9 The effect of proanthocyanidins from the Ligustrum lucidum ait on superoxide anion radical

3 結論

本研究利用響應面分析法對女貞子原花青素的超聲提取工藝進行優化。首先通過單因素試驗，觀察了提取時間、超聲功率、液料比和乙醇體積分數4個因素對女貞子原花青素提取率的影響。在此基礎上，采用三因素四水平的響應面分析法進行試驗，優化得出女貞子原花青素最佳的提取工藝是提取時間33 min，超聲功率400 W，液料比27∶1（mL/g），乙醇濃度 50%。經方差分析顯示模型擬合度較高。通過驗證性試驗證實在最優條件下原花青素的提取率達2.85%，與預測值2.90%十分接近。由此可見，該模型能有效指導女貞子原花青素提取工藝條件的優化，通過響應面分析法優化女貞子原花青素提取工藝在實踐上是可行的。此外，本研究結果還表明，當原花青素濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率可達到97%；對O2-·的清除率可達到60.14%；對·OH的清除率可達到78.88%。女貞子原花青素提取物具有良好的體外抗氧化活性。