響應面法優化微波輔助酶解制備抗性淀粉工藝研究

（鶴壁職業技術學院，河南鶴壁 458030）

玉米抗性淀粉是一種難消化淀粉，在體內消化緩慢，其性質類似溶解性纖維，食用后血糖升高較慢[1-2]，受到糖尿病患者和愛美人士的青睞[3]。目前，抗性淀粉的主要制備方法有壓熱處理法、超聲波輔助法、微波輻射法、蒸汽加熱法、酶解法等。尤其是超聲波輔助在玉米抗性淀粉的制備過程中得到了廣泛應用，如牛春艷等[4]利用超聲波輔助法制備了玉米抗性淀粉，研究了淀粉乳含量、超聲時間、超聲功率、超聲溫度和回生時間等因素對抗性淀粉收率的影響。楊小玲等[5]利用超聲酶解法制備了玉米抗性淀粉，研究了超聲時間、加酶量及添加劑種類和用量等因素對玉米抗性淀粉的影響。但采用微波糊化加酶解輔助制備玉米抗性淀粉的報道還較少，研究酶解條件亦鮮見報道。玉米抗性淀粉制備過程中采用微波加熱糊化處理可以使糊化過程更加徹底[6]，同時添加酶水解可促進產物中直鏈分子的產生，形成更多的玉米抗性淀粉晶體[7]。

響應面分析法，即響應曲面設計方法（response surface methodology，RSM），是利用合理的試驗設計方法并通過試驗得到試驗數據，解決多變量問題的一種統計方法[8-11]。本文以玉米抗性淀粉收率為指標，進行Box-Behnken試驗設計，探討了微波輔助酶解制備玉米抗性淀粉的酶解試驗條件。

1 材料與方法

1.1 主要材料

耐高溫α-淀粉酶（30 000 U/g）：南京添嘉生物科技有限公司；普魯蘭酶（1 000 U/mL）：河南果晨生物科技有限公司；葡萄糖淀粉酶（100 000 U/g）：西安拉維亞生物科技有限公司；胃蛋白酶（2 500 U/g）：河南吉乾生物科技有限公司；無水葡萄糖：江蘇泰楚化工有限公司；3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鉀、鹽酸、氯化鉀等：天津市科密歐化學試劑有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設備

UV1800型紫外-可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；WGLL-30B型電熱鼓風干燥箱：北京中興偉業儀器有限公司；76-1A型電熱恒溫水浴鍋：蘇州威爾實驗用品有限公司；800B型低速離心沉淀機：上海安亭科學儀器廠；G90F25CN3L-C2型格蘭仕微波爐：廣東格蘭仕電器廠。冷水迅速冷卻后轉移至25 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，用分光光度計在520 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線[13]。

1.3.3 玉米抗性淀粉含量測定

稱取1 g待測玉米抗性淀粉置于50 mL離心管中，加入10 mL pH 1.5的鹽酸-氯化鉀緩沖液混勻，向混合液中加入0.2 mL胃蛋白酶溶液，在40℃恒溫條件下振蕩1 h；冷卻至25℃，調節pH值至6.2左右，加入1 mL耐高溫α-淀粉酶溶液，在37℃恒溫水浴條件下振蕩15 h；冷卻至25℃，離心洗滌，所得殘余物加入蒸餾水少許、4 mol/L氫氧化鉀溶液3 mL振蕩混勻，調節pH值至4.5，加入葡萄糖淀粉酶液，在60℃恒溫水浴條件下繼續振蕩40 min。冷卻、離心、收集上清液、水洗，合并上清液，轉移至100 mL容量瓶中，加入蒸餾水定容，在波長為520 nm處測定溶液吸光度，用葡萄糖標準曲線計算葡萄糖含量，用下列公式求得玉米抗性淀粉收率[14-16]：

1.3.4 玉米抗性淀粉制備工藝優化單因素試驗

以玉米抗性淀粉收率為響應指標，采用單因素輪換法依次考察耐高溫 α-淀粉酶添加量（0、1、2、3、4、5、6、7 U/g干淀粉）和酶解時間（0、10、20、30、40、50、60 min）、普魯蘭酶添加量（0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 U/g）和酶解時間（0、1、2、3、4、5、6、7、8 h）4 個因素對微波輔助酶解制備玉米抗性淀粉收率的影響。

1.3.5 玉米抗性淀粉制備工藝響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，使用Design Expert軟件的Box-Behnken進行響應面優化試驗[17-18]，優化微波輔助酶解制備玉米抗性淀粉工藝。

1.3 主要方法

1.3.1 玉米抗性淀粉制備工藝

稱取一定量的玉米淀粉溶于蒸餾水中，調成淀粉濃度為30%的乳狀液置于微波爐中，在功率為800 W條件下加熱110 s使淀粉乳糊化，加入耐高溫α-淀粉酶水解一定時間，調節溫度80℃后加入普魯蘭酶進行酶化反應，冷卻到25℃。4℃老化24 h，離心分離。80℃干燥16 h，粉碎過篩，得到玉米抗性淀粉[12]。

1.3.2 葡萄糖標準曲線的制作

選擇pH為3、4、5、6、7，超聲波功率為160、200、240、280、320、360、400 W，超聲波處理溫度為40、50、60、70 ℃，超聲波處理時間為20、30、40、50 min，酶用量為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%，液料比為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g，回流溫度為30、40、50、60、70 ℃和回流時間為1、2、3、4、5 h作為因素，每次只改變一個因素，固定其它幾個因素，利用單因素實驗的方法考察各因素的影響.

利用二硝基水楊酸法測定葡萄糖，分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 葡萄糖標準液于 25 mL具塞刻度試管中，加入蒸餾水至2 mL，分別加入2 mL 3、5-二硝基水楊酸試劑后于沸水浴中加熱6 min，用

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果及分析

單因素試驗結果見圖1。

由圖1a和圖1b可看出，玉米抗性淀粉收率隨著耐高溫α-淀粉酶添加量的增加和酶解時間的延長逐漸升高，最大值出現在添加量為2 U/g干淀粉～4 U/g干淀粉、酶解時間20 min～40 min時。這是由于淀粉酶從淀粉中間隨機切斷糖苷鍵，從而有利于形成抗性淀粉。當酶添加量過少或過多時，會造成淀粉分子被切斷程度不足或過量，均不利于結晶的形成。同時淀粉酶切斷糖苷鍵與酶解時間成正比關系，酶解時間短時，分子被切斷程度小[19-20]，而如果酶解時間太長，分

圖1 單因素試驗結果Fig.1 Single factor test results

子鏈可能會被切得過短，這都不利于結晶的形成。

由圖1c可看出，玉米抗性淀粉收率隨著普魯蘭酶添加量的增多逐漸升高，在7 U/g干淀粉～9 U/g干淀粉時達到最大，隨后基本不再增加，這是由于當普魯蘭酶達到一定量后，酶的作用基本已經完成；由圖1d可知，隨著普魯蘭酶酶解時間的延長，玉米抗性淀粉收率先增大后減小，在酶解時間4 h左右達到最大值，超過4 h后隨著酶解時間的延長玉米抗性淀粉收率開始下降，這是由于酶反應時間過長會導致淀粉分子聚合度變小，反而使玉米抗性淀粉收率更低。

2.2 Box-Behnken試驗結果與分析

2.2.1 模型的建立及方差分析

根據單因素試驗結果，以玉米抗性淀粉收率為響應值，以耐高溫α-淀粉酶添加量和酶解時間、普魯蘭酶添加量和酶解時間4個因素為考察因素，抗性淀粉收率為響應值（Y），Box-Behnken試驗因素與水平見表1，試驗設計及結果見表2，試驗方差分析見表3。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface test design and results

續表2 響應面試驗設計及結果Continue table 2 Response surface test design and results

表3 響應面試驗方差分析Table 3 Response surface test variance analysis

由表3可知，多元回歸所建立模型的P小于0.000 1，表明建立的回歸方程極顯著；失擬項P大于0.05，失擬項不顯著，表明模型具有較高的可靠性，回歸方程的擬合度較高[23-24]；模型的相關性系數為0.947 8，說明預測值與試驗值有較高的相關性，調整決定系數為0.895 7，說明近90%的響應值能用所建模型解釋，能夠較好地描述試驗結果；信噪比S/N 13.771大于4，表明信號充足，也說明所建模型比較可靠；模型的二次項A2、B2的P 值小于 0.000 1，達到極顯著水平，C2、D2小于 0.05，達到顯著水平[25]，說明試驗考察的4個因素對響應值不是簡單的線性關系，它們的改變對玉米抗性淀粉收率的變化率影響較大。通過方差分析結果可知，4個因素對玉米抗性淀粉收率的影響主次順序為D>B>A>C，即普魯蘭酶酶解時間>耐高溫α-淀粉酶酶解時間>耐高溫α-淀粉酶添加量>普魯蘭酶添加量。這也說明在酶添加量不足時，可以延長酶解時間來提高玉米抗性淀粉的收率，且制備過程中最后一步酶解占重要地位。

2.2.2 響應面分析

由響應面回歸方程繪制響應面三維圖像和等高線見圖2～圖7。

圖2 耐高溫α-淀粉酶添加量和酶解時間對抗性淀粉收率的響應面Fig.2 Response surface of the yield of resistant starch with the high temperature resistant α-amylase addition and hydrolysis time

圖3 耐高溫α-淀粉酶和普魯蘭酶添加量對抗性淀粉收率的響應面Fig.3 Response surface of the yield of resistant starch with the addition of thermostable α-amylase and pullulanase

圖4 耐高溫α-淀粉酶添加量和普魯蘭酶酶解時間對抗性淀粉收率的響應面Fig.4 Response surface of the yield of resistant starch with the addition of thermostable α-amylase and the hydrolysis time of pullulanase

圖5 耐高溫α-淀粉酶酶解時間和普魯蘭酶添加量對抗性淀粉收率的響應面Fig.5 Response surface of the yield of resistant starch with the high temperature resistant α-amylase hydrolysis time and pullulanase addition

圖6 耐高溫α-淀粉酶和普魯蘭酶酶解時間對抗性淀粉收率的響應面Fig.6 Response surface of the yield of resistant starch with the high temperature resistant α-amylase hydrolysis time and the hydrolysis time of pullulanase

圖7 普魯蘭酶添加量和酶解時間對抗性淀粉收率的響應面Fig.7 Response surface of the yield of resistant starch with the addition of pullulanase and the hydrolysis time

由圖2可知，固定普魯蘭酶添加量和酶解時間，隨著耐高溫α-淀粉酶添加量增加和酶解時間的延長，玉米抗性淀粉的收率均表現為先升高后降低，響應面呈現凸形，說明二者有最佳值[26-27]。由圖7可知，固定耐高溫α-淀粉酶添加量和酶解時間，隨著普魯蘭酶添加量增加和酶解時間延長，玉米抗性淀粉的收率同樣也表現為先升高后降低，但二者的改變對玉米抗性淀粉收率的變化影響較小，沒有耐高溫α-淀粉酶引起的玉米抗性淀粉收率變化明顯，另外響應面也呈現凸形，說明二者同樣有最佳值。由圖3～圖6可知，兩種因素對玉米抗性淀粉收率的影響不同，一種因素改變使得玉米抗性淀粉收率改變，而另一種因素改變幾乎不影響玉米抗性淀粉收率，這也說明兩種酶的加入只與自身添加量和酶解時間有關，對另一種酶作用效果不產生影響，在三維圖形中顯示為一邊幾乎為水平線。

2.2.3 響應面優化結果驗證

利用Box-Behnken設計對響應面試驗結果進行優化，得到最佳工藝參數為：耐高溫α-淀粉酶添加量3.02U/g、酶解時間30.36min，普魯蘭酶添加量8.09U/g、酶解時間4.25 h，玉米抗性淀粉收率為15.165%。

根據響應面試驗預測的最佳生產工藝，為便于開展試驗研究，將試驗參數調整為耐高溫α-淀粉酶添加量3 U/g、酶解時間30 min，普魯蘭酶添加量8 U/g、酶解時間4.5 h，進行3次重復性驗證試驗，測得的玉米抗性淀粉收率平均為15.08%，基本接近預測值，表明響應面法優化微波輔助酶解制備玉米抗性淀粉工藝的可靠性較高。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，通過響應面法優化微波輔助酶解制備玉米抗性淀粉工藝得到影響玉米抗性淀粉收率的因素主次關系為普魯蘭酶酶解時間>耐高溫α-淀粉酶酶解時間>耐高溫α-淀粉酶添加量>普魯蘭酶添加量。最佳工藝參數為：耐高溫α-淀粉酶添加量3 U/g、酶解時間30 min，普魯蘭酶添加量8 U/g、酶解時間4.5 h。對利用Box-Behnken設計優化的最佳工藝參數進行驗證試驗，測得的玉米抗性淀粉收率平均值與預測值基本吻合，表明本試驗利用響應面優化的最佳工藝參數具有實際參考意義。