海洋鏈霉菌來源的脂肪酶OUC-Sb-lip2的異源克隆表達及其富集DHA的應用

王雪斐, 高坤鵬, 孫建安*, 毛相朝,2

1.中國海洋大學食品科學與工程學院，青島 266000;2.青島海洋科學與技術國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，青島 266000

脂肪酶(EC 3.1.1.3), 廣泛存在于動植物和微生物中，能夠催化酯類化合物(長鏈酰基甘油，≥10 個碳原子)的合成與水解。脂肪酶作用過程發生在油水的界面之上，因此被稱為“界面反應”，能夠催化酯化、轉酯、醇解和氨解等多種反應，其蛋白結構預測結果表明其屬于 α/β 折疊水解酶家族。

脂肪酶廣泛存在于自然界中，脂肪酶在催化反應時，所需條件簡單，能耗較低，效率較高，脂肪酶在工業生產中成為重要的催化劑。在食品加工、洗滌工業、營養保健品、廢水處理、油脂水解、精細化工和醫藥等行業都具有良好的應用前景[2,3]。然而傳統工業中所使用的商業化脂肪酶或酯酶的種類少之又少，原因可能是大多數酶的存在形式不穩定，難以保存和多次重復利用；催化性質及反應效率不好等。因此，篩選性質穩定，反應效率高的脂肪酶對于商業化產業的發展十分重要。脂肪酶也具有從天然魚油(藻油)中富集DHA的應用潛力。

ω-3多不飽和脂肪酸具有多種生理功能，受到人們廣泛的關注和研究，其中ω-3脂肪酸是生物細胞膜磷脂的重要成分，是人體不能合成的必需脂肪酸，在人體發育中具有重要的作用[1, 2]。二十二碳六烯酸(DHA, 22 : 6ω-3)作為ω-3家族中最具代表性的成員，是與降低心血管疾病的幾率[5,6], 維持神經系統[4]和免疫系統[6,7]以及抑制細胞內炎癥水平有關的有效成分[8](與炎癥因子釋放有關)。ω-3多不飽和脂肪酸是生物細胞膜磷脂的重要組成成分，在人體發育中具有重要的作用[9,10]。海洋魚油(甘油酯形式)仍然是人類ω-3 PUFAs的主要來源，一些海洋單細胞生物(如破囊壺菌，裂殖壺菌，隱孢子蟲)是ω-3 PUFAs的替代來源[11,12]。然而，ω-3 PUFAs的總量在15%～45%之間；DHA的含量隨種類不同而不同，通常在5%～40 %之間，DHA天然理想來源的裂殖壺菌通常也不超過40%。

天然魚油是DHA的重要來源，但其中DHA的濃度受到魚油來源的限制，如何提高天然魚油中的DHA含量，是提高DHA相關產品使用價值的重要環節多項研究表明，與甘油酯型相比，乙酯型DHA吸收性較差[13,14]，其中DHA甘油單酯，甘油二酯型的人體利用度及友好度更高[15]。但是在天然來源中，ω-3 PUFAs的含量較低(14%～45%)，需要通過采用一定的手段進行富集。但是傳統富集手段存在反應條件劇烈，副產物多，環境友好度低等缺點。近年來，以酶催化的方法得到更多青睞，酶法富集有諸多優點：催化效率高、反應條件溫和、能耗低等。使用具有sn-1,3選擇性的脂肪酶水解后，飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸被從甘油骨架上水解下來，DHA相應地在sn-2位富集(如圖1-a所示)。而脂肪酸選擇性水解是指脂肪酶偏向選擇碳鏈長度不同及碳鏈飽和度不同的脂肪酸，將其從甘油骨架水解下來[16]。

本研究使用海洋鏈霉菌ATCC 15855T(StreptomycesbacillarisATCC 15855T)來源的脂肪酶OUC-Sb-lip2基因，并使用枯草芽孢桿菌WB800作為異源表達的宿主對其進行克隆表達后，研究了其酶學性質；接著探索了使用水解甘油三酯型DHA以將DHA富集到甘油單酯上的最優反應條件。

1 材料與方法

1.1 主要材料

表1 主要實驗材料

1.2 主要儀器

表2 主要實驗儀器

1.3 方法

1.3.1脂肪酶OUC-Sb-lip2的序列分析

將來源于海洋鏈霉菌(S.bacillarisATCC 15855T)[17]的OUC-Sb-lip2 DNA序列根據已報道的方法進行分類，然后對OUC-Sb-lip2基因進行多序列比對，利用ESPript 3.0網站對序列的比對結果進行在線展示和輸出；使用SMART等在線網站對其蛋白序列進行進一步結構分析。

1.3.2枯草芽孢桿菌WB800/OUC-Sb-lip2菌株的構建

根據脂肪酶基因序列以及pP43NMK質粒載體基因序列，使用SnapGene 5.0.5及DNAMAN 8.0軟件設計的引物序列如表3所示。以脂肪酶OUC-Sb-lip2的基因片段作為模板，使用無縫拼接技術構建重組質粒pP43NMK-OUC-Sb-lip2。測序正確后，將提取的重組質粒導入WB800宿主細胞，陽性克隆驗證結果正確后，接種于低鹽LB培養基(50 μg/mL，Kana)，20 ℃，220 r/min 低溫培養24 h，誘導重組菌株WB800/OUC-Sb-lip2表達目的蛋白并分別收集發酵液上清和沉淀。最后使用SDS-PAGE分別檢測上清液和細胞沉淀破碎液中目的蛋白是否正確表達。

表3 引物序列

1.3.3OUC-Sb-lip2的純化

利用載體上的His-tag標簽蛋白與鎳柱結合這一性質，使用不同濃度梯度的咪唑-Tris-HCl 緩沖液(pH 8.0)洗脫下來，收集有蛋白洗出的相對應濃度咪唑的洗脫液。純化結果將通過SDS-PAGE蛋白凝膠電泳進行檢測, 并測定樣品中蛋白質含量和脂肪酶酶活。

1.3.4脂肪酶酶活檢測及定義

酶活測定：首先在1.5 mL的EP管中加入500 μL 100 mM，pH 9.0的 Tris-HCl緩沖溶液，然后置于相應溫度的水浴鍋中預孵育5 min；再向EP管中加入150 μL的粗酶液，隨即立馬加入40 μL底物溶液(對硝基苯酚棕櫚酸酯，20 mM)。混合均勻后將各EP管密封后放在37 ℃的水浴鍋中反應5 min；取出立即加入SDS溶液使酶失活，并吸取200 μL至96孔酶標板中檢測A405值。脂肪酶酶活單位(U)定義為：1 min內獲得 1 μmolpNP(對硝基苯酚)生成量所需要添加的酶量。

1.3.5脂肪酶OUC-Sb-lip2的酶學性質研究

對脂肪酶OUC-Sb-lip2的酶學性質進行了以下的研究：水解底物的碳鏈長度偏好性測定、最適溫度及其溫度穩定性測定、最適pH及其pH穩定性測定以及金屬離子對酶活影響的研究。

1.3.6脂肪酶OUC-Sb-lip2在富集甘油單酯型DHA上的應用

使用脂肪酶OUC-Sb-lip2的發酵液上清的真空冷凍干燥產物催化水解反應。研究了反應溫度、加酶量與底物的比例、乳化劑類型、反應體系中底物魚油與水的比例以及反應時間對水解DHA甘油三酯的影響。反應結束后，使用乙酸乙酯萃取水解產物并吹干后取10 μL用1 mL正己烷(色譜級)復溶，避光保存待測。通過高效液相色譜檢測(HPLC)研究甘油三酯水解率，甘油單酯生成率，還需要通過氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)檢測最終生成的甘油單酯中DHA的含量比例。

HPLC檢測條件如下：

色譜柱：正相RX SIL硅膠柱(Agilent)

流動相：正己烷∶異丙醇=9∶1

流速：1 mL/min 柱溫箱：36 ℃

紫外檢測波長：205 nm 進樣量：10 μL

GC-MS檢測條件設置如下：

Agilent HP-INNOWAX Capillary Column 30 m*0.25 mm*0.25 μm 1993-113

進樣口溫度：240 ℃； 分流比設置為1∶20；

火焰離子檢測器(FID)溫度：230 ℃ ；EI電子能量為70 eV；

升溫程序：初始溫度170 ℃，并保持170 ℃ 3 min后，以1.5 ℃/min速率升溫至280 ℃，維持8 min。

2 結果與討論

2.1 OUC-Sb-lip2的序列分析

利用海洋鏈霉菌(S.bacillaris)全基因組測序的注釋信息，使用ESPript 3.0在線網站對序列進行輸出(圖2-c)，使用SignalP 4.1 prediction軟件預測序列發現OUC-Sb-lip2 第1-29個氨基酸(MKMSRLVAFSSSLLLGDSLA LTGAGIANA)為一段信號肽(圖2-a)。后續使用SMART網站預測蛋白結構域的結果(圖2-b)，也證明具有一段第二家族特征性保守序列(GDSL)。綜合上述，OUC-Sb-lip2是屬于脂類水解酶第II家族。

a: SignalP 4.1軟件對OUC-Sb-lip2編碼的信號肽預測結果; b: SMART對OUC-Sb-lip2基因編碼的蛋白結構域的預測結果; c: ESPript 3.0多序列比對結果的輸出圖2 OUC-Sb-lip2基因編碼信號肽及蛋白結構域的預測

2.2 脂肪酶OUC-Sb-lip2的表達和純化結果

使用表3設計的引物，以OUC-Sb-lip2的基因片段為模板，擴增OUC-Sb-lip2序列后，利用無縫克隆技術將其與pP43NMK質粒連接，獲得重組質粒。并將這些重組質粒成功轉入宿主枯草芽孢桿菌WB800細胞中。陽性克隆驗證核酸電泳如圖3-a所示。

獲得OUC-Sb-lip2的發酵上清液后，利用載體上的His-tag標簽蛋白與鎳柱結合這一性質，并使用不同濃度的咪唑-Tris-HCl 緩沖液(pH 8.0)洗脫下來，利用SDS-PAGE蛋白電泳來檢測鎳柱純化的結果。純化結果如圖3-b所示，可以看出目標蛋白成功地被100 mmol/L濃度的咪唑洗脫下來。在置換溶液完成后，OUC-Sb-lip2的純酶被收集到1.5 mL的EP管中于4 ℃生物冰箱中保存，等待進行下一步對酶學性質的研究。

2.3 脂肪酶OUC-Sb-lip2的酶學性質研究

研究脂肪酶OUC-Sb-lip2的最適水解底物，使用了從C2-C16 八種不同碳鏈長度的對硝基苯酚酯作為水解底物。從圖4-a中可以看到，OUC-Sb-lip2對碳鏈長度 >8的對硝基苯酚酯的水解活性比較高，其中最適的碳鏈長度為C8, 對C10、C12、C14、C16底物的水解活性都大于或接近80%，且水解效果均好于短鏈底物。

從圖4-b的結果可以看出，脂肪酶最適反應溫度為40 ℃，在25 ℃～40 ℃范圍內，脂肪酶的酶活逐漸上升；當反應溫度大于40 ℃后，隨著溫度升高，酶活逐漸下降，在60 ℃時剩余酶活最低。在35 ℃～45 ℃范圍內，剩余酶活力保持在90%以上。酶的溫度穩定性如圖4-c所示，在緩沖液中孵育24h后，在40 ℃時檢測到最高的殘余脂肪酶活性，剩余活性為97%，經過孵育60 h后，觀察到所有實驗組剩余酶活性均超過50%。結果表明，OUC-Sb-lip2對底物對硝基苯酚棕櫚酸酯的水解活性表現出中高溫穩定性。

a: 底物最適性的研究；b: 最適溫度的研究；c: 溫度穩定性的研究；d: 最適pH的研究；e: pH穩定性的研究；f: 金屬離子對酶活的影響圖4 脂肪酶OUC-Sb-lip2的酶學性質研究

如圖4-d所示，OUC-Sb-lip2被檢測到最高脂肪酶活性的pH為9(在Tris-HCl緩沖液中)，Tris-HCl緩沖液在很大程度上促進了酶的活性。由圖4-e可看出，在pH 9.0(Tris-HCl 緩沖液)的條件下，OUC-Sb-lip2酶活最高且溫度穩定性表現較好，因此，生產時將環境pH控制在9(Tris-HCl緩沖溶液)時酶活最高最穩定。10 mmol/L K+、Fe3+、1 mmol/L Ca2+、10 mmol/L Mg2+、10 mmol/L Zn2+、1 mmol/L Mn2+、Ba2+增強了酶活性，其中10 mmol/L Fe3+可使其增加150%以上(圖4-f)；而10 mmol/L Ni2+、10 mmol/L Cu2+對酶活抑制作用顯著，可使相對酶活降低到25%以下。在高等生物中，鈣可以結合于關鍵的信號轉導途徑，在其中調節多種蛋白質的構象，活性和相互結合作用。 KATIYAR[18]等人研究了Fe3+對Candida rugosa脂肪酶(CRL)的脂肪酶酶活的影響，在使用CRL水解棉籽油的過程中添加了Fe3+溶液，并觀察到酶活提升至原酶活的127%。而Fe3+對脂肪酶OUC-Sb-lip2的酶活促進明顯高于CRL，這對工業生產具有一定的參考意義。

2.4 OUC-Sb-lip2在富集甘油單酯型DHA上的應用

如圖5-a所示，在20 ℃至30 ℃溫度梯度之間，甘油三酯水解率隨著溫度的升高而升高，曲線于30 ℃達到最高點(85.88%)；然而當反應溫度高于30 ℃時，水解率隨著溫度的升高而降低，可能由于溫度變高，酶逐漸失活。確定的最佳的反應溫度是30 ℃；而水解產物中生成的甘油單酯(MAG)比例也是在30 ℃處達到最高，占水解產物總含量為25%。

隨著加酶量/底物的比例的增加OUC-Sb-lip2的水解活性也在逐漸增加(圖5-b)，當加酶量/底物的比例達到1 600 U/g時(水解率79%)，甘油三酯的水解率的變化趨于平緩，此時水解產物中生成甘油單酯占總組分含量最高。添加不同乳化劑的水解效果優勢順序為：司班系列(20、80)>曲拉通X-100 > 空白(無乳化劑有酶)> 吐溫系列(20、80)，司班80對反應體系乳化效果最好，且達到甘油三酯最高水解率(81.45%)，其中水解產物中生成甘油單酯的比例占總組分的23.8%。如圖5-d所示，脂肪酶OUC-Sb-lip2對DHA甘油三酯水解效率隨著緩沖溶液的含量的增加，呈現先上升后下降的趨勢；水解率和甘油單酯生成量最優點均為油/水(緩沖溶液)比例為2∶1(w/w)處，此時甘油三酯的水解率可達到82%，甘油單酯的生成量占總組分的比例為23%。

a: 溫度(℃)；b: 加酶量/底物(U/g)；c: 乳化劑類型；d: 底物/緩沖液(w/w)圖5 OUC-Sb-lip2在富集甘油單酯型DHA上的應用

在上述最優條件下研究反應時間梯度對水解DHA甘油三酯的影響。由圖6-a可以看出，當反應時間到達24 h后水解率和甘油單酯的生成率的上升幅度明顯減緩。24 h時，甘油三酯水解率測定為80.7%，而48 h后水解率僅僅增加了0.8%，推測脂肪酶的水解能力達到飽和。圖6-b為空白實驗組與在最佳條件下反應得到的水解產物的甘油酯組分HPLC檢測結果，甘油單酯的出峰時間為8.337 min，最終水解率為81.9%，甘油單酯的含量是8.62 mg/mL。

對水解產物中的甘油單酯組分進行GC-MS檢測，結果如圖7所示，m/z342.2的峰是DHA甲酯的質譜信號。其中，DHA在甘油單酯中的脂肪酸占比為97.2%。與已經報道多種來源的脂肪酶相比，來自海洋鏈霉菌的OUC-Sb-lip2通過水解反應生成DHA甘油單酯顯示出較為良好的效果。HOSSEINI等人[19]以及RICE[20]等人對南極假絲酵母和假絲酵母來源的脂肪酶分別進行了研究，發現兩者通過水解反應富集DHA的含量分別為33.74%和72.10%。TAIWO等人[21]通過控制水解速率和程度，利用南極假絲酵母脂肪酶A(CAL-A)的脂肪酸選擇性用于生產DHA濃縮物；CAL-A[21]沒有區域選擇性，水解藻油可得到82%DHA和11% DPA(占總脂比例)。綜上，海洋鏈霉菌來源的脂肪酶展現出較好的DHA富集效果。

3 結論

來源于海洋鏈霉菌的脂肪酶OUC-Sb-lip2屬于脂類水解酶第Ⅱ家族，將OUC-Sb-lip2應用于水解甘油三酯型DHA以將DHA富集到甘油單酯上，通過優化反應得到條件：魚油與緩沖液比例為1∶1(w/v)，反應溫度為30 ℃，加酶量與底物之比1 600 U/g，反應24 h；最終可達81.9%的水解率，DHA甘油單酯的生成量為8.62 mg/mL。