沙福芽孢桿菌氧化磷酸化通路相關基因對錳脅迫的應答

龍 紅, 牛 熙, 黃世會, 冉雪琴, 王嘉福

貴州大學農業生物工程研究院/貴州大學動物科學學院， 貴州 貴陽 550025

三磷酸腺苷(ATP)是由腺嘌呤、核糖及3個磷酸基團連接組成，水解時釋放大量能量，是生物體內最直接的能量來源。在產能代謝過程中，微生物可通過底物水平磷酸化和氧化磷酸化將有機物分解或無機物氧化過程中釋放的能量儲存在ATP分子中，用于DNA復制、轉錄和蛋白合成等生理過程[1]。當胞內的線粒體異常和氧化磷酸化途徑受損時，底物水平磷酸化可發揮其作用彌補ATP的合成。但生命活動所需能量主要來源于氧化磷酸化，這種方式合成的ATP約占總數的95%。[2-4]。氧化磷酸化途徑由電子傳遞鏈(electron transport chain,ETC)和磷酸化兩部分構成，電子通過ETC產生跨膜的質子梯度即質子動勢，用于驅動ATP合酶合成ATP[5]。

錳是生物體不可缺少的微量元素之一[6]。錳過氧化氫酶[7]、錳超氧化物歧化酶[8]以及磷酸化酶等都需要錳作為輔因子，參與細菌能量代謝和抗氧化等重要生理過程[9]。當環境中的錳過量導致細菌胞內錳過剩，則會引發錳毒害作用。研究表明錳脅迫時，可導致線粒體的能量代謝失活[10，11]，細胞內的ATP水平降低，并證明能量不足是發生錳毒害的主要原因[12]。ATP合成酶在氧化磷酸化中起核心作用，細菌的ATP合成酶由膜內的疏水結構域F0和膜外可溶的親水頭部F1兩部分組成，F0具有質子運輸功能，將質子傳遞給二磷酸腺苷(ADP)和無機磷酸鹽(Pi)在F1中合成ATP結合[13-15]。F1的α3、β3和γ亞基由atpA、atpD和atpG編碼[16]。α亞基是ATP合成酶的催化結構域，敲除atpA基因使ATP生成量下降，抑制大腸桿菌的呼吸作用[17]。敲除M.smegmatis的atpD基因，不僅引起ATP合成量下降、呼吸減慢，同時生物膜減少[18]。分枝桿菌的蛋白組學研究發現，atpG對細胞存活起至關重要的作用[19]。細胞色素bc1氧化酶和細胞色素C氧化酶是電子傳遞鏈的兩個末端氧化酶，是電子傳遞鏈中的關鍵酶，細胞色素bc 1氧化酶亞單位由qcrB基因編碼，細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ由ctaD基因編碼[20，21]。這些基因控制著細菌的氧化磷酸化過程。

我們從錳礦土壤中分離到一株沙福芽孢桿菌S7，其耐錳能力高達2 200 mg/L[22]。本文選擇耐錳菌株S7，研究錳脅迫條件下，ATP合成酶和細胞色素亞基編碼基因的時序性變化，從能量代謝角度解析細菌對錳脅迫的應答機制。

1 材料與方法

1.1 菌株

該菌株S7是分離于貴州省松桃自治縣錳礦土壤，經鑒定為沙福芽孢桿菌[21]。

1.2 培養基、試劑和培養條件

PYCM培養基：胰蛋白胨0.8 g，酵母粉0.2 g，K2HPO40.1 g，MgSO4.7H2O 0.2 g，NaNO30.2 g，CaCL20.1 g，(NH4)2CO30.1 g，蒸餾水1 L，調節pH為6.8～7.0，固體培養基加2%瓊脂粉。LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L，固體培養基加1.5%瓊脂粉。1×105Pa滅菌20 min。

MnCl2·4H2O溶于滅菌的三蒸水，配制濃度為505 mmol/L的溶液，以0.22 μm孔徑的微孔濾膜過濾除菌，4 ℃冰箱保存。將1 mol/L HEPES稀釋100倍，調節pH為8.0左右，以0.22 μm孔徑的微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃冰箱存放。稱取0.04 g LBB粉末溶解于250 μL冰乙酸中，再加水定容至100 mL，需避光保存于4 ℃冰箱。

S7菌株活化，涂布于PYCM固體平板，28 ℃培養箱內倒置培養，挑取單菌落擴大培養至對數期，以1%的接種量加入200 mL PYCM液體培養基。

1.3 液體中Mn(Ⅱ)氧化定量

KMnO4標準曲線法[23]可定量測定菌株的錳氧化活性，配制1 mmol/L的KMnO4母液，將其稀釋成12個等濃度梯度的溶液，分別取以上稀釋液50 μL于EP管中，再加入250 μL LBB試劑，均勻混合，避光反應30 min。取200 μL反應混合物于96孔板中，酶標儀檢測OD620的吸光值。以KMnO4濃度為橫坐標，OD620值為縱坐標制作KMnO4標準曲線，公式為y=5.404 2x+0.126 9。測待測樣品的OD620吸光值，在KMnO4標準曲線上計算對應的KMnO4濃度，該濃度值的2.5倍就是MnO2的濃度，再除以培養的時間最終得到該菌對Mn(Ⅱ)的氧化活性。

將沙福芽孢桿菌接種到250 mg/L Mn (II)的液體培養基中, 28 ℃，180 r/min，培養3 d，培養基中出現棕褐色沉淀，取1 mL 菌液離心, 去上清,加入50μLHEPES懸浮菌液，再加入250 μL LBB試劑。將體系置于25 ℃暗處反應 30 min，設置3個技術重復。

1.4 固體平板Mn(Ⅱ)氧化定性

在分別含Mn (II)濃度為0 mg/L和250 mg/L的PYCM固體培養基中均勻涂板，28 ℃倒置培養7 d，用LBB指示劑噴灑培養基表面，若為陽性菌株則呈藍色，陰性菌株無色。

1.5 RT-qPCR

以沙福芽孢桿菌(BacillussafensisKTCC)的全基因組序列為模板，設計5個基因的特異性引物(表1)。提取細菌總RNA，反轉錄成cDNA，經PCR擴增得到目的基因片段，連接pGEM-T Easy載體，轉化感受態大腸桿菌DH5α，于50 mg/L氨芐青霉素的固體LB平板篩選陽性克隆，提取測序正確的克隆菌株質粒，以10倍梯度稀釋作為DNA模板，繪制標準曲線，計算擴增效率。RT-qPCR的擴增程序：95 ℃預變性，15 min；95 ℃變性，10 s；63 ℃，30 s；40個循環數；溶解曲線的設置為95 ℃，15 s，55 ℃，15 s，95 ℃，0.5 s。以16S rRNA為內參基因[24]，采用2-ΔΔCt方法[25]計算基因的相對表達量。為減少樣品之間的誤差，每個樣品重復測定3次。

表1 RT-qPCR引物

2 結果

2.1 沙福芽孢桿菌的錳氧化活性及變化

在固體氧化測定中，經過LBB試劑的顯色反應，金色葡萄球菌的平板顯些許淡藍色，而沙福芽孢桿菌的平板則呈明顯深藍色(圖1)，說明沙福芽孢桿菌較金色葡萄球菌具有強的錳氧化作用。為進一步測定沙福芽孢桿菌的錳氧化活性，利用LBB試劑能特異性結合Mn(IV)和Mn(III)這一特點(圖2)，通過高錳酸鉀標準曲線法進行定量測定，最后計算得到MnO2的濃度的平均值為23.25 μmol/L，該菌株的錳氧化活性約為7.75 μmol/(L·d)。為進一步證實沙福芽孢桿菌的錳氧化特性，將無錳培養和有錳培養的沙福芽孢桿菌做掃描電鏡(SEM)，結果顯示無錳培養的沙福芽孢桿菌表面光滑，而有錳培養的沙福芽孢桿菌表面則附著明顯的錳氧化物(圖3)。經過以上試驗佐證，證實沙福芽孢桿菌確實為錳氧化細菌且具有錳氧化能力。錳氧化物的變化曲線則顯示沙福芽孢桿菌在0 h～4 h之間沒有發生錳氧化，4 h ～16 h之間發生劇烈的變化，8 h達到峰值，而之后下降，16 h后又回升(圖4)。說明沙福芽孢桿菌的錳氧化(錳耐受)不是一個固定不變的進程，而是具有時序性變化的。

1：LBB原液對照；2：沙福芽孢桿菌；3：沙福芽孢桿菌+Mn(Ⅱ)

圖4 錳氧化物含量變化

2.2 基因的擴增及測序

以沙福芽孢桿菌cDNA為模板，經擴增，分別獲得123、133、113、150、108 bp基因片段，經克隆測序，與BacillussafensisKCTC參考基因組比對，各基因測定序列與參考基因組序列的相似性均為100%。

2.3 克隆菌株的構建與表達

提取qcrB、ctaD、atpA、atpD、atpG5和16S rRNA6個基因的陽性克隆菌株的質粒, 梯度稀釋8倍, 以質粒為模板進行PCR擴展，繪制6個基因的標準曲線。結果見表2, 6個基因的線性關系數(R2)范圍在0.992～0.998之間，具有較好的線性關系。擴增效率均在90%～110%之間，符合RT-qPCR對擴增效率要求，說明6個基因的擴增效率好，有利于進行下一步上樣試驗。

根據沙福芽孢桿菌的生長曲線[26]，結合細菌20 min就能繁殖一代的生理習性。設置培養時間點為0.3 h、0.6 h、1 h、4 h、8 h、16 h和32 h，錳作用濃度設置為0 mg/L、250 mg/L、2200 mg/L，經定量PCR檢測，5個基因的表達量4 h前維持在低水平，4 h之后開始上升，8 h達到峰值，16 h表達量最低，atpA基因32 h時再次達到峰值，形成雙峰趨勢(圖5～圖9)。

表2 標準曲線和擴增效率

圖5 atpA基因的表達變化

圖6 atpD基因的表達變化

圖7 atpG基因的表達變化

圖8 qcrB基因的表達變化

圖9 ctaD基因的表達變化

3 討論與結論

本試驗以16S rRNA為內參基因，研究在不同培養時間、不同錳脅迫條件下，qcrB、ctaD、atpA、atpD和atpG5個基因的表達情況。依據q-PCR的結果，發現沙福芽孢桿菌在低濃度或高濃度錳脅迫下均呈現相似的表達模式，即5個基因的表達量在4 h前維持低水平表達且穩定，8 h到達峰值，但在4 h ～16 h之間發生表達量的劇烈變化。

生命體內發生的各種生理活動都需要ATP的支持[27]。近年來對生物體受到重金屬脅迫研究中發現，氧化磷酸化、碳同化和三羧酸循環途徑都參與到了細胞的抗毒害活動中，通過促進細胞恢復能量產生和提高能量轉化效率來解毒，證實了能量衰竭可能是造成毒害的原因[28-30]，近年來的研究證明ATP合酶基因在抗脅迫中起作用。大腸桿菌DH5α中過表達atpA基因，在一定程度上改善了菌體的生長[31]。在脅迫條件下，ATP合酶的亞基增多，意味需要更多的ATP合酶將質子輸出到胞外，達到保護細菌的目的[32]。本研究發現，atpA基因的表達在8 h和32 h有雙峰，32 h是沙福芽孢桿菌在2 200mg/L錳脅迫下的對數生長期點，在大腸桿菌過表達atpA基因也是在對數期提高菌體數量，但沒有出現表達的雙峰模式。研究不同pH條件下，atpD基因在兩株乳桿菌(Lp9和Lp91)的表達情況，發現Lp91顯現更強的耐酸性且atpD基因的表達量高于另一菌株，表明ATP合酶可能是胃內益生菌在遇到胃內強酸環境脅迫下的耐受性中起關鍵作用，而且在不同的酸性條件下，atpD基因的表達受到正調控[33]，這與我們的試驗結果一致，在不同錳濃度脅迫下，atpD基因的表達受到正調控。atpG基因在不同時間的脫水脅迫條件下均有表達且具有明顯變化，可能參與了砂蘚的脫水脅迫應答。將海洋藻類和淡水藻類的atpG基因轉入大腸桿菌，發現轉入海洋藻類atpG基因的大腸桿菌耐鹽性高于另一組，說明該基因參與了逆環境的脅迫應答[34，35]。qcrB常作為結核分枝桿菌耐藥性研究的藥物靶點，通過抑制氧化磷酸化，消耗體內ATP儲存來抑制結核分枝桿菌的生長[36，37]。ΔctaD菌株呈現較差的生長性，且ΔctaD中細胞色素bc1的表達水平均低于野生型[38]。目前關于氧化磷酸化與能量代謝關系的研究，主要集中在基因的功能性研究，缺乏對基因表達的時序性研究。

微生物和動植物受外界環境脅迫會發生氧化應激，產生的活性氧會抑制其生長[39，40]。在前期研究中發現，錳脅迫條件下，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性在10 h前維持低水平表達，10 h后開始上升，14 h到達峰值之后逐漸減少，到34 h又開始有上升趨勢[26]。推斷細菌在錳脅迫下，前8 h受到氧化應激的抑制作用，而此時細菌內超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性較低，不能抵消活性氧的毒害，增加ATP合成量，可能用于外排錳，以減少錳對細胞內蛋白的毒害作用，5個基因在此階段表達上調。在10 h ～14 h，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性急劇提升大約3倍，降低了胞內的氧自由基的毒害作用。此時細菌不需要更多的ATP來抵抗氧化應激，對應時間點5個基因的表達急劇下降。研究結果表明，耐錳菌沙福芽孢桿菌S7的能量代謝水平隨著作用時間和濃度的提高而上升，以產生大量的ATP應對錳毒害作用。