甘油葡萄糖苷αGG的制備方法及其研究進展

徐 愷， 李 麗， 付銘洋， 陳昱金， 徐 錚,2*

1.南京工業大學食品與輕工學院，南京 211816；2.材料化學工程國家重點實驗室，南京 210009

甘油葡萄糖苷是一種由葡萄糖基和甘油通過糖苷鍵連接而成的糖苷化合物，其基本結構見圖1。它是植物和微生物在脅迫條件下自發合成的一種滲透保護物質(Osmolyte)；它可以保護細胞免受高滲透壓、高溫、干旱以及紫外線等惡劣環境的破壞[1]。在日本清酒、味噌、米醂中也發現含有甘油葡萄糖苷[2]，一些異養細菌以及光合藍藻在鹽脅迫條件下也可以特異性合成并積聚甘油葡萄糖苷，它可作為可溶性有機分子的小分子量官能團的一種兼容溶質。到目前為止，在自然界中已鑒定出六種結構不同的甘油葡萄糖苷，它們分別具有不同的糖苷鍵或者不同的立體化學結構[3-5]，其中以α糖苷鍵構成的包括：2-O-α-D-glucosylglycerol(αGG，圖2a)、(2S)-1-O-α-D-glucosylglycerol(2S-1-αGG，圖2b)、(2R)-1-O-α-D-glucosylglycerol(2R-1-αGG，圖2c)。以β糖苷鍵構成的包括：2-O-β-D-glucosylglycerol(2-βGG，圖2d)、(2S)-1-O-β-D-glucosylglycerol(2S-1-βGG，圖2e)和(2R)-1-O-β-D-glucosylglycerol(2R-1-αGG，圖2f)，β類GG僅在高等植物中發現[6]。研究表明，αGG的甜度是蔗糖的55%，具有高耐熱性、低熱色性、低吸濕性、高持水性以及低美拉德反應等特點；不同于葡萄糖，在αGG存在時，人唾液中的口腔細菌不會產生酸，表現出非致齲性[2]。由于其具有低吸水性、高保濕性的特點，αGG可作為化妝品原料，用于提高皮膚的保濕效果[7,8]，可以消除潔面后皮膚的緊繃感[9]；另外，αGG是一種大分子穩定劑，可用于蛋白質藥物等的長期保存[10]。

圖1 αGG(2-O-α-D-glucosylglycerol)的結構式示意圖

1 αGG的來源

在極端干旱的沙漠中，卷柏、密羅木等植物即使喪失自身質量高達98%的水分，仍可頑強生存度過旱季，并在雨季重新煥發活力，這種現象源于密羅木會產生一類天然防護物—壓力防護分子。德國Bitop AG公司研究表明，αGG就是植物密羅木的主要活性成分，也是其能避免棲息地惡劣條件侵害的關鍵。密羅木累積了這種活性物質，它能保護植物結構不被破壞，缺水時，通過調節細胞內滲透壓，減少水分流失到細胞外，保護植物不會被完全干燥；下雨時，αGG激活密羅木的細胞功能，快速進行細胞修復。目前，αGG可以通過化學法[12]、酶催化合成法[13]以及合成生物學方法[14-15]合成。但是化學法存在產物沒有選擇性，無法獲得單一純品GG的問題；而合成生物學法目前產量較低，暫難以工業化；酶催化法相對而言更有產業化價值。雖然現階段已有多種αGG的合成方式，但是已報道的αGG產物分離方法還比較少；目前只有奧地利格拉茨工業大學的GOEDL等[13]人(2008)通過混合活性炭與硅藻土為分離介質從酶反應體系中吸附-洗脫獲得了較高純度的αGG[15]。

2 αGG的結構和性質

αGG的基本理化性質如表1所示：

表1 αGG的理化性質

αGG不僅可以在密羅木中發揮“復活”作用，對人體皮膚也具有保濕、防紫外線傷害等效果。αGG如今在護膚行業受到廣泛關注，非常適合添加在天然類護膚品中。αGG不僅可以作為化妝品保濕，也可以作為細胞激活劑使用[16]，因為其具有以下優異性能：①增加細胞活力和新陳代謝;②激活再生皮膚細胞;③增強皮膚細胞的抗氧化能力(SOD);④加速老化細胞中Ⅰ型膠原蛋白前體的合成。除了以上功效之外，αGG還具備一定的保健功效。研究發現αGG在治療過敏性呼吸系統疾病[17]、保護眼角結膜[18]等具有潛在應用價值；另外，αGG與目前具有代表性的抗糖尿病藥物voglibose有著相似的結構，所以其對腸道內雙糖消化有相似的抑制作用，因此在降低血糖方面也可能發揮一定作用[19]。對于αGG還有眾多功效和性質未被發現，但目前所展現出的性質已有了足夠的利用價值，相信隨著對其更加深入的研究，將會被運用到更多的領域。

3 αGG的制備方法

目前合成αGG的方法主要有化學法、酶催化合成法以及合成生物學方法。

3.1 化學合成法制備αGG

Tatsuuma-Honke釀酒公司報道了通過化學法合成αGG、2S-1-αGG和2R-1-αGG的技術，它們都是米酒中甘油葡萄糖苷的活性成分。利用高碘酸鈉和硼氫化鈉可催化麥芽糖醇為αGG，產率有18%。之后又利用乙酸、四乙酸鉛和硼氫化鈉催化異麥芽糖得到的2S-1-αGG，產率為12%。以海藻糖為原料，用四醋酸鉛經乙二醇裂解合成了比例為73%：27%的2S-1-αGG和2R-1-αGG混合物，但產率僅為5%。正如TAKENAKA等[2]在文獻中提到的，化學合成方法得到的αGG轉化率太低、副產物多，因此后續純化步驟將是非常復雜且不經濟的。

3.2 蔗糖磷酸化酶催化合成αGG

αGG也可通過蔗糖磷酸化酶催化蔗糖和甘油獲得。蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)是一種特異性的轉糖苷酶[8]，曾在食品和制藥工業中得到了較為廣泛的應用，如在低聚糖的合成中[20,21]、化合物的羥基化修飾[22]等。蔗糖磷酸化酶大都存在于嗜糖假單胞菌Pseudomonassaccharophila[23]、長雙歧桿菌Bifidobacteriumlongum[24]、巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium[25]、變異鏈球菌Stococcusmutans、腸膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides中。蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)屬于13糖基水解酶的酶家族[26]，主要催化兩種反應：第一類，把蔗糖中的葡萄糖基轉移到受體上。例如，磷酸在蔗糖磷酸化酶催化下能夠生成1-磷酸-葡萄糖和D-果糖[26]；第二類，它可以把1-磷酸-葡萄糖中的葡萄糖基轉移到受體中。例如，D-果糖和1-磷酸-葡萄糖在蔗糖磷酸化酶催化下能夠生成蔗糖。在沒有外部影響的條件下，蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7)催化蔗糖和磷酸鹽轉變成α-葡萄糖1-磷酸(α-G-1-P)和D-果糖的可逆轉化[27]。在不存在磷酸鹽的情況下，甘油可以攔截與蔗糖反應的β-葡糖基酶中間體以產生αGG，另有微弱的水解副反應發生。因為在野生型菌株中有著非常復雜的代謝調控機制，所以在野生型菌株中的蔗糖磷酸化酶含量很低。自然菌株發酵生產得到的蔗糖磷酸化酶產量少，所以使用這種方法無法滿足工業大規模生產運用的需求。因而，使用基因工程方法構建重組菌株，使腸膜明串珠菌大量表達，這對工業化大量生產αGG、提高生產效率有很大的幫助。目前使用最廣的蔗糖磷酸化酶主要來自于BifidobacteriumlongumsplP、Bifidobacteriumadolescentis[28]和Leuconostocmesenteroides[29]的基因。其中BifidobacteriumlongumsplP基因長度是2.7 kb，已有報道的蔗糖磷酸化酶與其推測的氨基酸序列酶有較高同源性；在大腸桿菌中進行表達后，生成分子量為56 kDa的蛋白。在腸膜明串珠菌中，蔗糖磷酸化酶含有1 479個核苷酸，在大腸桿菌進行表達后所得重組蛋白相對分子量也在56 000左右。使用1-磷酸-葡萄糖和蔗糖作為供體時，蔗糖磷酸化酶都普遍具備受體特異性。在培養基優化后，獲得的蔗糖磷酸化酶活性可達1.49 U/mg。BifidobacteriumadolescentisSucP基因包含1 515個核苷酸，它在大腸桿菌中進行表達后，獲得了二聚體酶，它的分子量為58 kDa。BifidobacteriumadolescentisSucP與蔗糖磷酸化酶基因具有很高的同源性[30]。蔗糖磷酸化酶當用1-磷酸-葡萄糖當作糖基供體時，只能用阿拉伯糖、阿拉伯糖醇以及木糖醇作受體，但以蔗糖作糖基供體時，受體范圍比較廣，并且活性更高[31]。

3.3 通過合成生物學制備αGG

αGG的合成可以通過由鹽脅迫處理寡養單胞菌(StenotrophomonasrhizophilaDSM14405)[14]或藍藻等微生物[32]合成。與化學合成法和酶合成法相比，通過微生物合成GG具有產物成分簡單、轉化過程環境友好等優勢。藍藻(又叫藍綠藻或藍細菌)是原核生物，大多數藍藻的細胞壁外面有膠質衣，因此又稱為粘藻。在藻類中，藍藻是最簡單、最原始的單細胞生物，如微囊藻、念珠藻、魚腥藻等。藍藻沒有細胞核，細胞中央有核物質，通常呈顆粒狀或網狀，色素均勻的分布在細胞質中。核物質沒有核膜和核仁，但具有核的功能，故稱為原核(或擬核)。藍藻中有環狀DNA質粒，擔當運載體的作用。為了適應環境中的鹽脅迫，藍藻合成并積累包括αGG在內的一些相容性物質用于平衡細胞內外的滲透壓和水勢[32]。通過基因工程手段改造藍藻集胞藻Synechocystissp. PCC6803，提高了藍藻細胞中αGG的合成效率并實現了αGG產物向胞外的部分分泌[33]。αGG的生物合成水平取決于藍藻的培養條件，尤其是外部氯化鈉的濃度，在氯化鈉的最大允許濃度范圍內，αGG的生物合成是隨著胞外氯化鈉濃度的增加而增加[34]。除了鹽，還有氮、二氧化碳和光的供應也可能影響藍藻細胞中αGG的合成[35]。利用藍藻生產αGG，能夠在單一細胞內實現從二氧化碳到αGG產品的直接轉化，具有高轉化效率和低碳排放的特點，但藍藻生產過程難以放大，因此該法制備αGG應用于工業化生產還有待時日。總之，現在已經開發了特別有效和選擇性的轉糖苷酶方法。這個過程應該為αGG作為工業化學品的生產提供基礎，但是由于大多數產品的生產成本較高以及產品產率較低等限制，因此目前仍處于起步階段。

4 αGG的分離與純化

雖然現階段已有多種αGG合成方式，但已報道的αGG下游分離方法還比較少。到目前，僅有利用活性炭以及樹脂吸附分離αGG產物的研究報道。粉末活性炭以及葡聚糖凝膠G-15都能有效地從含有αGG的反應液中吸附分離αGG。但是當葡聚糖凝膠G-15處在高鹽條件下時，αGG就不能被有效地洗脫出來。而粉末活性炭不單單能夠從高濃度αGG標準樣品中將αGG吸附分離出來，也能夠從鹽脅迫藍藻培養液中(也就是含鹽的αGG溶液)吸附分離αGG；再利用高效液相色譜進一步對產物進行分離純化，使αGG達到較高純度。但現有的分離純化方式費用較高，過程相對復雜，對αGG工業化生產及應用有很大的限制。

4.1 葡聚糖凝膠G-15層析柱分離有鹽溶液αGG

將葡聚糖凝膠G-15干粉進行預處理，使葡聚糖凝膠G-15干粉達到完全溶脹的狀態[36]；使用預先處理后的葡聚糖凝膠G-15吸附分離αGG，洗脫液為蒸餾水，控制流速為0.8 mL/min，采集吸附分離后的αGG溶液。在高鹽條件下的GG溶液，雖然葡聚糖凝膠G-15對αGG的吸附率可以達到100%，但是結果顯示，對于有鹽αGG溶液，αGG的洗脫率僅有35.5%。這有可能是由于有鹽αGG溶液中的高濃度的鹽離子(約600 mmol/L氯化鈉)干擾了αGG洗脫，造成αGG洗脫率偏低[37]。

4.2 活性炭吸附分離αGG

取αGG溶液25 mL，按一定比例加入粉末活性炭，密封，在溫度28 ℃、速度120 r/min的搖床上震蕩30 min后取出，用真空抽濾器抽濾，將得到的已吸附樣品的活性炭用不同濃度的乙醇進行重懸；相同條件下搖床震蕩30 min后取出，進行真空抽濾，取濾液。將吸附前、吸附后以及乙醇洗脫后得到的液體，各取樣1 mL稀釋50倍，按相同的方法進行離子色譜測試[38]。結果表明粉末活性炭對不同濃度的標準αGG溶液中的αGG都有吸附作用，且對1.7 g/L～12 g/L這一濃度范圍的αGG都能有效吸附和洗脫。此外，粉末活性炭能夠有效吸附藍藻集胞藻PCC6803突變株ΔggtCDΔggPR培養液中的αGG，吸附率為83%左右，而乙醇洗脫率也可以達到70%以上。對于有鹽的αGG溶液，當活性炭使用量小于5 g時，含鹽的αGG溶液的洗脫率隨著活性炭用量的增加逐步升高；但當使用量大于5 g時，洗脫率卻有所下降。這可能是活性炭用量過少時，活性炭未能充分吸附溶液中的αGG，因而降低了洗脫率。而活性炭用量超過一定量時，溶液濃度是固定的，被吸附的αGG的量也是固定的，從而造成洗脫率下降；隨者乙醇濃度的增加，粉末活性炭對αGG溶液吸附后的洗脫率也隨之逐步增加。當乙醇濃度為50%時，粉末活性炭對αGG的洗脫能力最大，洗脫率可以達到75%以上。當再一次提高乙醇濃度，洗脫率卻有所下降，因為粉末活性炭為非極性吸附劑[39]；隨著乙醇-水的比例增加洗脫能力隨之增強，當比例達到1∶1時，洗脫能力最大。綜上，確立了活性炭用量5 g，濃度50%的乙醇為活性炭從有鹽αGG溶液中吸附分離αGG的最佳條件，得到83.9%αGG吸附率，76.6%洗脫率。

5 甘油葡萄糖苷αGG的應用

αGG是微生物在脅迫條件下合成的一種滲透保護物質(osmolyte)；它可以保護細胞免受高滲透壓、高溫、干旱和紫外線等惡劣環境的破壞，因此αGG可作為細胞激活劑[16]。另外，αGG可作為蛋白質和酶的穩定劑，能夠在高溫或冷凍干燥條件下穩定蛋白質或酶等生物大分子結構[42]。其次，αGG還可以修復受損細胞，促進傷口愈合再生(如激光治療、化學品致脫皮等的修復)。αGG在化妝品中充當細胞激活劑，它具有這些性能：(1)強效有力地激活細胞并且促進細胞再生;(2)增強細胞的活力和加快細胞新陳代謝的進程;(3)刺激皮膚細胞讓其重新生長;(4)增強表皮膚細胞的抗氧化能力(SOD);(5)加快老化細胞中I型膠原蛋白前體合成。

5.1 αGG的保濕性能

根據德國Bitop AG公司研究發現αGG具有與透明質酸類似的鎖水力，但其分子量要比透明質酸鈉小5 000倍，因此其制成的化妝品膚感不粘膩，透氣性好。眾所周知，在低水合度時，膜之間的水很少，膜面受到側向應力變成膠狀。膠化后的膜，單個脂分子面積降低，膜厚度增加，此時αGG的滲透和體積能使水合度提高，膜間距增大，側向應力降低，膜在低水合度狀態下依然能保持流體狀。隨著αGG濃度的增加，滲透壓也增加，在負水勢狀態下，高滲透壓可使吸引力減小(即低負壓)，從而使膜間水分流失減少，膜平均間距增大，水合力減小，因此αGG能夠保護細胞膜的穩定，鎖住水分。德國Bitop AG公司以安慰劑做控制樣，選擇20名45歲皮膚正常衰老的女性測試者，每天兩次涂抹含質量比為1% αGG的霜，在四周之后分別測試每名女性的皮膚保濕性、彈性以及光滑度，其實驗結果發現(與安慰劑對比)，使用劑量1%的αGG使皮膚的保濕性增加了23.3%，彈性度增加了93.3%，光滑度增加了61.8%。

表2 αGG合成方法的比較

5.2 αGG減輕皮膚發紅(抗紅疹)性能

德國Bitop AG公司對GG的抗紅疹性能進行體內實驗的研究，20名男、女受試者，分別在背部的4個區域涂抹(1處不涂+3處涂測試霜)含安慰劑霜、2%GG霜以及0.5%積雪草霜的三款產品，涂抹標準2 μL/cm2。利用TiVi?600測量紅血球濃度，觀察皮膚微循環變化，在紫外線照射48 h后，涂抹含安慰劑霜、2%GG霜以及0.5%積雪草霜的3種霜，反映有積極效果的受試者比例分別為35%、76%和41%。因此，實驗證明，2% αGG霜具有緩解曬傷的作用，能夠極大地減少紅疹，因此αGG未來可以作為防曬類產品添加劑。

5.3 αGG延緩細胞衰老

αGG能夠加速老化細胞中I型膠原蛋白前體的生成。德國bitop AG公司在對αGG的延緩細胞衰老的體外實驗中，利用老化的真皮成纖維細胞，分別用0.2%、0.5%、1.5%的αGG處理老化的成纖維細胞72 h，測試其老化纖維細胞合成I型膠原蛋白的能力。研究發現，用0.17%、0.5%、1.5%的αGG處理的老化成纖維細胞對比正常水平的細胞，其合成I型膠原蛋白的量分別增加了11%、27%、36%。因此，αGG能減緩真皮成纖維細胞的老化進程，提升老化細胞中膠原蛋白的生成量，能夠提高細胞氧化性以及增強細胞活力。德國Bitop AG公司在測定αGG對細胞的氧化性和細胞活力影響的體外實驗中，用1% αGG培養老化的細胞72 h、96 h、120 h和144 h，分別與未用αGG的老化細胞進行比較，在測定老化細胞中SOD1的量之后發現，αGG能夠顯著增加老化細胞中SOD1的生成量，αGG處理的老化細胞SOD1的生成量比未處理的老化細胞提高了280%。在測定細胞中葡萄糖的消耗量時發現，αGG能將老化細胞的細胞活力增加170%，使細胞的新陳代謝明顯加快，ATP增加并激活細胞再生。

a：不涂；b：安慰劑；c：積雪草；d：GG圖3 αGG及測試霜抗紅疹實驗對比圖

5.4 αGG能促進傷口愈合/組織修復

德國Bitop AG公司在傷口愈合系列實驗(間接皮膚模型和cDNA序列)中表明αGG具有優異的傷口愈合功效。與對照組(安慰劑)相比，傷口愈合速度明顯加快。在間接體內皮膚模型實驗中，用αGG處理傷口48 h后已經愈合。傷口愈合是應對皮膚感染的一種重要的適應性響應，對維持體內平衡必不可少[43]。受傷后，愈合過程迅速開始并經歷三個階段：發炎期、增殖期、重建期。這是一個有序復雜的過程，很多細胞在其中活躍，包括發炎、生長因子或細胞因子釋放，細胞遷移以及增殖。表皮再生包括角質細胞和成纖維細胞的增殖、遷移，還有分泌影響其他細胞的細胞因子和生長因子[44]，生長因子TGF-β1是一種已知的參與傷口愈合的細胞因子[45]；FGF7是一種成纖維細胞和角質細胞生長因子，也參與到傷口愈合過程，而αGG能誘導這兩種生長因子的表達，從而引發真皮細胞的增殖。此外，還能加強活性氧清道夫CAT，SOD2，TRDX的表達，這些活性氧清道夫的表達對傷口愈合至關重要[46]。

5.5 αGG在保健方面作用

在保健方面，αGG主要存在以下三方面作用：(1)與蔗糖不同，αGG存在的情況下人類唾液中口腔細菌不會產酸，表明αGG具有非致齲性；(2)αGG可能應用于糖尿病的治療，αGG不可以被唾液淀粉酶、胃液或者胰腺淀粉酶消化，在實驗中只能被大鼠腸道菌群部分水解。同時，αGG的存在可以有效抑制大鼠腸道菌群對麥芽糖、異麥芽糖以及蔗糖的消化，有一種治療糖尿病的代表性藥物—Voglibose與αGG有類似的結構，且對腸道二塘的消化也具有類似的作用；(3)αGG對促進益生菌生長，增強腸道耐受性極具潛力[47]，這為αGG作為具有保健功能的食品添加劑提供了可能。

5.6 αGG作為大分子穩定劑方面作用

在作為蛋白穩定劑的應用方面，αGG主要是在冷凍保存過程中穩定一些商業化的蛋白產品，例如治療用蛋白或工業化酶等，通常會發生變性從而導致失活。已經有研究通過建立一些酶保護模型證實αGG可以作為蛋白穩定劑使用[31,32]。同時，還研究了高溫或者低溫下αGG作為蛋白穩定劑對于不同酶的穩定作用，研究表明αGG完全可以取代傳統蛋白穩定劑[48]。

6 總結

作為活性化合物，αGG顯示了它對人皮膚的潤濕作用，對大分子的穩定作用以及非致齲齒性。因此，αGG在化妝品、人類健康和制藥行業有著許多潛在的應用。然而，市面上卻很少有αGG類型的產品，其中最主要的原因是由于它的價格昂貴(3 000元人民幣/kg，αGG含量50%)，這可能是由于缺乏經濟生產過程αGG。為了降低αGG的價格，需要創新技術來提高αGG的生產效率。在化妝品應用方面，自然界中許多天然物質都具有很好的保濕效果[49]，同時這些天然提取物還對皮膚有其他營養價值，但目前生產成本過高，導致這些真正有價值的產品還未能得到普及。用天然物質中提取的優秀保濕劑代替現有的化學合成保濕劑，必將成為未來化妝品行業的焦點。