基于GBS測序開發(fā)SNP在植物上的應用進展

薛曉杰 杜曉云 蓋藝 唐巖 孫燕霞 宋來慶 姜中武

摘要：基因分型測序（genotyping by sequencing，GBS）因具有實現(xiàn)相對簡單、成本較低、可產生高通量SNP的優(yōu)點而受到青睞。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）因簡單、快速、特異性強、穩(wěn)定遺傳、便于檢測等特點已成為目前最廣泛使用的分子標記之一。本文就利用GBS技術開發(fā)SNP分子標記近年來在親緣關系評價、重要農藝性狀鑒定、遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構建以及基因定位等方面在國內外的研究進展進行綜述，并對其今后的研究提出展望，以期為其在植物上的更廣泛應用提供參考。

關鍵詞：SNP分子標記;GBS技術;簡化基因組測序;遺傳圖譜構建;QTL定位;基因定位

中圖分類號：S184 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0062-07

收稿日期：2020-040-02

基金項目：山東省外專雙百計劃（編號：WST2018013）;山東省重點研發(fā)項目（編號：2018GHZ005）。

作者簡介：薛曉杰（1994—），女，山東煙臺人，碩士研究生，主要從事果樹分子與生理技術研究，E-mail：xuexiaojieYT@163.com;共同第一作者：杜曉云（1979—），女，山西呂梁人，博士，高級農藝師，主要從事果樹生物技術育種研究，E-mail：duxiaoyunduzi@163.com。

通信作者：姜中武，博士，研究員，主要從事果樹育種與栽培技術研究。E-mail：jiangzhongwu@163.com。隨著分子生物學的發(fā)展，分子標記技術發(fā)展迅速，基因組測序技術日漸成為標記開發(fā)的重要手段。簡化基因組測序（GBS）技術近年發(fā)展起來。GBS技術可以捕獲基因組重要區(qū)域，獲得大量單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），且無需已知基因組信息[1]。目前，SNP分子標記在果樹、蔬菜和花卉等植物上已被成功應用于遺傳圖譜構建、數量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）、全基因組關聯(lián)分析、基因定位等方面的研究，GBS被認為是分子標記輔助選擇的最高級應用。但基于GBS技術開發(fā)SNP分子標記的研究在植物上尚無詳細報道。本文簡要介紹GBS技術發(fā)展情況，著重概述其近年來在植物上的應用現(xiàn)狀和前景，以期為該方法的進一步廣泛應用提供參考。

1SNP分子標記

在分子育種發(fā)展過程中，若干分子標記類型得到開發(fā)?；陔s交的第一代分子標記限制性內切酶片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）是首次應用于植物基因分型的DNA標記?；赑CR的第二代分子標記主要包括隨機擴增多態(tài)性DNA標記（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）、序列特征性擴增區(qū)域（sequence characterined amplified regions，SCAR）、切割的擴增產物多態(tài)性序列（cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）、簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）和擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）等，它們均存在不同程度的缺點?；诮觑w速發(fā)展的高通量測序技術，第三代分子標記應運而生，其中，SNP在基因組中最為豐富，被證明更能高效、全面地揭示基因組變異信息。SNP分子標記由Lander提出，指某個堿基對出現(xiàn)替換、缺失或插入而引起的堿基序列改變，最終導致DNA序列多樣性[2]。該標記被首次應用于人類基因組計劃，檢測發(fā)現(xiàn)，人類DNA序列中每1.3 bp即可產生1個SNP[3]，證明SNP分子標記在基因組中分布密度較高。SNP根據位置分布可分為基因編碼區(qū)SNP（cSNP）、基因SNP（iSNP）和基因周邊SNP（pSNP），通常非編碼區(qū)變異率高于編碼區(qū)[4]。SNP具有突變頻率較低、等位基因較少、遺傳穩(wěn)定性較高和較其他標記分布范圍更廣等特點，為目前使用較為廣泛的分子標記之一。SNP的開發(fā)依賴于第二代測序技術（next generation sequencing，NGS）。隨著測序技術的迅猛發(fā)展，諸多植物基因組序列得到公布，擴大了SNP分子標記的檢測范圍。第二代測序技術通常使用高通量測序平臺，具有檢測速度快、精確度高和高通量等特點，又稱為高通量測序技術。其中，簡化基因組測序（GBS）技術逐漸成為國內外研究熱點，最近在植物上的應用迅速發(fā)展。

2GBS技術

GBS是利用二代測序技術在作物中發(fā)現(xiàn)和分型SNP的一種新應用[5]，其原理是使用限制性內切酶（RE）對DNA進行酶切，并對酶切片段兩端序列進行高通量測序，通過分析獲得的SNP信息進行基因分型，是一種快速、簡單、低成本的基因分型方法。該技術的關鍵是GBS文庫構建與生物信息分析，核心是使用ApiKI限制性內切酶來減少基因組的重復序列。2011年，Elshire等首次在玉米和大麥上進行GBS試驗，分別挖掘出約200 000個和 25 000 個序列標記，建立降低基因組復雜性的文庫，分析表明，該文庫適合大規(guī)模樣品進行標記篩選[6]。同為基于酶切的簡化基因組測序技術，與限制性位點關聯(lián)DNA測序技術RAD（restriction-site associated DNA sequencing）相比[7]，GBS技術步驟更簡單，DNA純化步驟少，無需進行片段大小選擇，可檢測到RAD技術無法處理的大量缺失基因型，尤其在分析多態(tài)性低和重復序列高的物種上更占優(yōu)勢，成本相對低廉。GBS技術在國內逐漸發(fā)展起來，目前已在部分植物上實現(xiàn)高效、大規(guī)模的基因組測序。

2.1GBS技術主要流程

GBS技術的重點是GBS文庫構建。進行GBS文庫構建或對基因組DNA酶切的關鍵是選擇甲基化敏感的RE和合適接頭。RE可影響DNA片段大小和數量[8]。選擇含有多個懸垂核苷酸的RE可有效提高接頭與DNA的連接效率，并能優(yōu)先從低拷貝基因區(qū)域生成片段[6]。選取酶切后的片段，用T4 DNA連接酶連接其兩端的接頭和條形碼（barcode）。酶切與連接通常不同時進行，除非選用特殊耐熱連接酶。連接結束后，以回收產物為模板進行PCR擴增，PCR擴增可使酶切片段兩端產生帶有不同接頭的核苷酸片段，混合樣品，再次回收DNA片段并純化。至此，GBS文庫準備就緒，將混和好的文庫使用Illumina高通量平臺測序;通常該平臺的測序錯誤率隨測序序列長度的增加而升高，堿基質量同時受到影響，另外堿基質量還可能受測序試劑和樣品等多方面影響，因此，提高測序堿基質量是一個有待解決的問題。為保證分析質量，根據建庫樣品與 barcode 對應關系，將原始測序數據Raw Reads 拆分為單樣品 Raw Reads，對其進行質控得到過濾后的數據Clean Reads，根據有無參考基因組分別將 Clean Reads 與參考基因組和構建的參考基因組進行比對，進而進行 SNP基因型分析?？赏ㄟ^進化樹構建、主成分分析、群體遺傳結構分析等進行SNP信息分析。

2.2GBS生物信息學發(fā)展

GBS發(fā)展需要生物信息學工具助力海量數據處理。近年來生物信息學分析流程迅速發(fā)展，其中幾條主要信息流程使用率較高。Sonah等開發(fā)了IGST-GBS分析流程，從所產生的序列中讀取調用SNP和DENEL，并在8種不同大豆基因型上進行了驗證[9]。Glaubitz等創(chuàng)建了TASSEL-GBS數據分析流程，可將原始GBS序列數據高效地處理成SNP基因型[10]，利用該信息學工具所讀取的堿基在后人的使用中被認為幾乎無錯誤[1]。Melo等開發(fā)了GBS-SNP-CROP，對可變長度成對末端基因分型的SNP和植物種質鑒定，尤其適用于目標種群多樣化程度過高情況[11]。Torkamaneh等綜合比較了7條GBS生物信息學流程，包括5條需要參考基因組的流程（TASSEL-GBS v1&v2、Stacks、IGST和 Fast-GBS）和2條無需參考基因組的從頭分析流程（UNEAK和Stacks），分析表明，F(xiàn)ast-GBS分析過程中產生的多態(tài)性SNP最多，準確性最高[12]。綜合結果表明，運用不同流程分析相同測序技術產生的SNP會使得SNP高度重疊，然而使用相同流程分析不同測序技術獲得的SNP，重疊相對較少。筆者認為，選擇適宜的生物信息學分析流程對于GBS分析結果具有較大意義，因此分析流程工具的開發(fā)與選擇對于預期研究至關重要。

3基于GBS開發(fā)SNP應用進展

GBS自開發(fā)一來，受到國內外研究者的青睞，目前在植物遺傳多樣性、遺傳圖譜構建、QTL鑒定、基因定位上有較好應用。

3.1親緣關系和遺傳多樣性

研究品種起源和親緣關系對地區(qū)種質資源的保護和利用具有重要參考價值，了解作物的群體結構和遺傳多樣性對基因關聯(lián)定位研究和基因組選擇至關重要[13]。利用GBS技術產生的SNP可有效地對種質資源親緣關系和遺傳多樣性進行研究，對此已有前人作過不少研究。

3.1.1親緣關系中的應用王曉柯等利用GBS技術對240份寬皮柑橘進行基因分型，共獲得了 114 200 個高質量的SNP位點，主成分分析結果顯示，240份寬皮柑橘被分為4大類，系統(tǒng)演化樹和主成分分析結果都揭示了不同地理來源和特定形態(tài)的寬皮柑橘在遺傳水平上存在明顯的差異[14]。Zhao等利用GBS技術、系統(tǒng)基因組學、群體遺傳學、轉錄組學和全葉綠體基因組學，推斷了核桃屬5種中國本地物種譜系形成的過程，驗證了核桃與水曲柳是一個園藝品種，發(fā)現(xiàn)冰川進退是與種群隔離有關的氣候變化事件，即使在基因流動和導入的情況下也是如此[15]。Wu等利用GBS技術對82個大葉繡球花品種的遺傳多樣性和群體結構進行研究，對大葉繡球栽培盤上發(fā)現(xiàn)的5 803個優(yōu)質SNPs進行了系統(tǒng)發(fā)育分析和分子變異分析，得出了大葉繡球的分類方法，證實“Preziosa”是大葉黃連的雜種[16]。Niu等利用GBS技術對貴州高原起源中心的415份茶樹樣本進行了首次群體遺傳分析，揭示了茶樹群體的連鎖不平衡模式、群體結構和遺傳分化，共鑒定出79 016個優(yōu)質SNP位點，確定了純野生型、混合野生型、古代型和現(xiàn)代型4個類群，并發(fā)現(xiàn)古代型和混合野生型的遺傳多樣性水平高于純野生型和現(xiàn)代型[17]。

3.1.2遺傳多樣性中的應用Taranto等使用GBS技術對辣椒資源進行SNP全基因組鑒定，并評估222個栽培辣椒基因型子集遺傳多樣性水平，貝葉斯和層次聚類分析結果表明，基因型在集群中的分布反映了物種的地理起源和果實相關特征[13]。Pavan等將GBS技術首次應用于甜瓜，通過對收集的72份材料的分析，檢測到25 422個SNPs，通過遺傳結構、主成分和層次聚類分析進行3個不同亞群的識別，每個亞群的遺傳分析結果揭示了與果實表型和地理起源相關的多樣性模式[18]。Solomon等通過GBS技術對辣椒進行基因分型，第一次全面地分析了埃塞俄比亞辣椒物種的遺傳變異，對142個辣椒種質資源中53 284個高質量SNP進行了模型的世系分析和系統(tǒng)發(fā)育樹、主成分分析，確定了2個不同的遺傳群體[19]。周萍萍等利用GBS技術對27 份來自中國的大粒裸燕麥材料進行測序，結合先前發(fā)表的包括6個六倍體燕麥種在內的66份燕麥材料的GBS數據進行SNP挖掘，并對其進行主成分分析、結構分析以及聚類分析，為栽培六倍體燕麥起源研究提供了理論依據[20]。

以上研究結果表明，利用GBS技術獲得的SNP群體結構信息可為遺傳圖譜研究、標記輔助選擇和物種起源研究提供基礎，證明GBS技術在基因分型中被高效運用，可準確地進行親緣關系和遺傳多樣性研究，挖掘大量基因組潛在信息，是一個高效可靠的工具。

3.2遺傳圖譜和重要農藝性狀

遺傳圖譜也稱連鎖圖譜，是以有多態(tài)性的遺傳標記為路標，以2個位點交換率為圖距的圖譜，其理論依據為染色體的交換和重組，是分子標記開發(fā)、基因鑒定等基因組信息挖掘的基礎。GBS是一種穩(wěn)定且經濟的方法，可以生成通用的全基因組SNP數據，適用于在高度雜合的農業(yè)物種中對多個群體構建整合連鎖圖譜[21]。

數量性狀由染色體中的多個基因控制，QTL的研究可以直接將目標性狀定位到相關基因。GBS技術的發(fā)展，成功使基于重組的基因分型來開發(fā)物種的QTL圖譜成為可能。近年來，植物上基于GBS技術開發(fā)SNP的應用主要集中在圖譜構建和QTL定位方面。

3.2.1在遺傳圖譜構建中的應用Lee等利用GBS技術構建甘藍型油菜的高分辨率遺傳圖譜，并對抗性基因進行鑒定，分別獲得甘藍型油菜2號和9號的2個主效QTL和1個主效QTL[22]。Ipek等使用GBS對125份橄欖DNA樣本進行分析，共鑒定出22 033個基于轉錄組的SNP標記，其中3 384個標記被映射到橄欖基因組中，構建包含1個CAPS、19個SSR和3 384個基于轉錄組的SNP標記的飽和遺傳圖譜[23]。Jo等首次采用GBS技術對洋蔥（無參考基因組）進行SNP挖掘，獲得1 851 428個SNP，構建洋蔥SNP遺傳圖譜[24]。Li等通過GBS技術構建了基于SNP的包含1 465個bin標記的甘藍高密度遺傳連鎖群，其基因組長度為128 577 cM，相鄰bin標記間的平均遺傳距離為0.88 cM[25]。Carrasco等利用通過GBS技術獲得的SNP構建日本李高密度連鎖圖譜，指明日本李子和桃子基因組具有高度的共線性[26]。遺傳連鎖圖譜的構建，將為物種重要農藝性狀的QTL定位、基因定位和候選基因挖掘提供有用的工具。

3.2.2重要農藝性狀中的應用Pootakham等利用GBS技術在油棕全基因組范圍內構建的遺傳圖譜上檢測到1個與果莖相關的QTL、3個控制植株生長的QTL和2個相關候選基因[21]。賴國榮等利用通過GBS技術獲得的SNP構建玉米高密度遺傳連鎖圖譜，并結合重組自交系群體籽粒脂肪含量、賴氨酸含量、蛋白質含量和淀粉含量共4個營養(yǎng)品質性狀的表型數據進行QTL定位，共檢測到20個與營養(yǎng)品質性狀相關的QTL[27]。Diouf等利用GBS技術從233個陸地棉群體中開發(fā)出由5 178個SNP標記組成的第1個高密度遺傳圖譜，鑒定出了與鹽度相關性狀的QTL，確定了8個集群，發(fā)現(xiàn)了12個可用于QTL精細檢測的可能關鍵基因[28]。Bhattarai等通過基于GBS的飽和SNP連鎖圖譜對水稻進行基因分型，確定了控制水稻根莖長、鮮根質量、分蘗數和根冠比等的14個QTL，并在QTL置信區(qū)間內發(fā)現(xiàn)了影響短根的重要基因，被認為通過控制細胞增殖和伸長來調節(jié)根的生長[29]。Zhang等以牡丹品種鳳丹和日月錦的雜交后代為母本，利用GBS技術檢測到257 335 738個優(yōu)質SNP標記，根據分布在5個連鎖群上共包含3 868個標記的完整遺傳圖譜分別測定了控制花數、花瓣長度、花瓣數和花期4個表型性狀的共6個QTL[30]。

諸多研究結果表明，基于GBS技術開發(fā)SNP在不同植物中構建遺傳圖譜并進行QTL定位均取得較好的效果，證明GBS是一個值得推薦的簡化基因組重測序技術。高分辨率的遺傳圖譜構建和精確的QTL檢測可以顯著縮小植物重要性狀的候選基因范圍[31]。

3.3基因定位

基因定位即測定基因在染色體上的位置，是遺傳機理研究的重要環(huán)節(jié)，對于深入了解植物遺傳信息具有重要作用。GBS技術可以深入到基因組重要區(qū)域，獲取的基因信息較為準確。Passianotto等使用GBS技術對大豆188個植物引種和5個品種進行基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)3個與線蟲抗性顯著相關的基因區(qū)域[32]。郭燕等利用GBS技術對100份古茶樹資源進行全基因組SNP挖掘，共鑒定出近55萬個高質量SNPs，為后續(xù)開展分子標記輔助育種和功能基因位點定位提供了基礎[33]。Gerardo等構建了由486個SNPs、11個SSR以及2個形態(tài)標記組成的桃遺傳連鎖圖譜，對可溶性固形物含量、成熟期和果肉粉質3個性狀進行QTL鑒定并確定了與其相關的候選基因[34]。高美玲等通過GBS技術分別對西瓜果形指數大于1.4和小于1.1的各10株個體進行基因分型，在3號染色體的 26.80～27.33 Mb 區(qū)段內定位到與西瓜果形有關的基因，并預測了14個候選基因[35]。楊柳等基于GBS技術獲得棗品種SNP標記后，對其進行主成分和遺傳多樣性分析，并解析棗品種的群體遺傳關系，通過基因功能注釋和富集分析確定了 6 個參與細胞周期或激素合成調控途徑的候選基因[36]。

通過研究發(fā)現(xiàn)，GBS技術可應用于不同物種SNP標記的獲?。ū?），在植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、重要農藝性狀定位以及相關基因定位等中均具有重要意義，這將有助于植物輔助育種和育種保護，也為后續(xù)的遺傳機理研究奠定了基礎。

4總結與展望

綜上所述，近年來國內外基于GBS技術發(fā)現(xiàn)的SNP在植物基因組中分布密集，證實了無需生物基因組信息的GBS技術是一個開發(fā)SNP強有力的工具。未來，隨著高通量測序技術、SNP分子標記技術和生物信息學技術的開發(fā)和進步，GBS-SNP有望開啟新一代分子標記與測序技術的重要里程。

目前，GBS-SNP在作物上應用較廣，在小麥、棉花、水稻等作物上的應用研究已趨于先進，而在果樹、蔬菜和花卉上的應用研究相對較少且不夠完善。利用GBS技術開發(fā)SNP在果樹方面的研究仍需不斷探索，例如果樹童期長、病害種類較多，GBS可作為一個方便高效選育優(yōu)良性狀的輔助育種工具;芽變選種中存在同名異物、同物異名的現(xiàn)象，GBS又可作為一個鑒定果樹親緣關系和遺傳多樣性的有效手段。從國內外研究對比來看，GBS技術在國外的使用較為廣泛，國內近3年以來發(fā)展迅速，但總體與國外在研究效率和范圍上有一定差距。因此，在今后GBS技術應用中，選用合適的限制性內切酶進行GBS文庫構建、高效的生物信息學流程進行數據分析以及減少測序堿基錯誤率將變得更為重要。后續(xù)研究中，結合代謝組學、轉錄組學與蛋白質組學進行完善的遺傳機理研究，對于我國植物育種保護具有重大意義。

參考文獻：

[1]Kim C，Guo H，Kong W Q，et al. Application of genotyping by sequencing technology to a variety of crop breeding programs[J]. Plant Science，2016，242：14-22.

[2]Lander E S.The new genomics： global views of biology[J]. Science，1996，274（5287）：536-539.

[3]Brookes A J.The essence of SNPs[J]. Gene，1999，234（2）：177-186.

[4]Wang D G，F(xiàn)an J B，Siao C J，et al.Large-scale identification，mapping and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome[J]. Science，1998，280（5366）：1077-1082.

[5]He J F，Zhao X，Laroche A，et al.Genotyping-by-sequencing（GBS），an ultimate marker-assisted selection （MAS） tool to accelerate plant breeding[J]. Frontiers in Plant Science，2014，5：484.

[6]Elshire R J，Glaubitz J C，Sun Q，et al.A robust，simple genotyping-by-sequencing （GBS） approach for high diversity species[J].? PLoS One，2011，6（5）：e19379.

[7]Baird Nathan A，Etter Paul D，Atwood Tressa S，et al.Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers[J]. PLoS One，2008，3（10）：e3376.

[8]Hwang K，Oh S，Kim K，et al.Genotyping-by-sequencing approaches using optimized two-enzyme combinations in Asian pears （Pyrus spp.）[J]. Molecular Breeding，2019，39（12）：1-9.

[9]Sonah H，Bastien M，Iquira E，et al.An improved genotyping by sequencing （GBS） approach offering increased versatility and efficiency of SNP discovery and genotyping[J]. PLoS One，2013，8（1）：e54603.

[10]Glaubitz J C，Casstevens T M，Lu F，et al.TASSEL-GBS： a high capacity genotyping by sequencing analysis pipeline[J]. PLoS One，2014，9（2）：e90346.

[11]Melo A T O，Bartaula R，Hale I. GBS-SNP-CROP：a reference-optional pipeline for SNP discovery and plant germplasm characterization using variable length，paired-end genotyping-by-sequencing data[J]. BMC Bioinformatics，2016，17（1）：29.

[12]Torkamaneh D，Laroche J，Belzile F. Genome-wide SNP calling from genotyping by sequencing （GBS） data：a comparison of seven pipelines and two sequencing technologies[J]. PLoS One，2016，16（8）：e0161333.

[13]Taranto F，DAgostino N，Greco B，et al.Genome-wide SNP discovery and population structure analysis in pepper （Capsicum annuum） using genotyping by sequencing[J]. BMC Genomics，2016，17（1）：943.

[14]王小柯，江東，孫珍珠. 利用GBS技術研究240份寬皮柑橘的系統(tǒng)演化[J]. 中國農業(yè)科學，2017，50（9）：1666-1673.

[15]Zhao P，Zhou H J，Potter D，et al.Population genetics，phylogenomics and hybrid speciation of Juglans in China determined from whole chloroplast genomes transcriptomes and genotyping-by-sequencing （GBS）[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2018，126：250-265.

[16]Wu X B，Alexander L W. Genetic diversity and population structure analysis of big leaf hydrangea using genotyping-by-sequencing[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，2019，144（4）：257-263.

[17]Niu S Z，Song Q F，Koiwa H，et al.Genetic diversity，linkage disequilibrium，and population structure analysis of the tea plant （Camellia sinensis） from an origin center，Guizhou plateau，using genome-wide SNPs developed by genotyping-by-sequencing[J]. BMC Plant Biology，2019，19（1）：328.

[18]Pavan S，Marcotrigiano A R，Ciani E，et al.Genotyping-by-sequencing of a melon （Cucumis melo L.） germplasm collection from a secondary center of diversity highlights patterns of genetic variation and genomic features of different gene pools[J].? BMC Genomics，2017，18（1）：53.

[19]Solomon A M，Han K，Lee J H，et al.Genetic diversity and population structure of? Ethiopian Capsicum germplasms[J]. PLoS One，2019，14（5）：e0216886.

[20]周萍萍，顏紅海，彭遠英，等. 基于高通量GBS-SNP標記的栽培燕麥六倍體起源研究[J]. 作物學報，2019，45（10）：1604-1612.

[21]Pootakham W，Jomchai N，Ruang-Areerate P，et al. Genome-wide SNP discovery and identification of QTL associated with agronomic traits in oil palm using genotyping-by-sequencing （GBS）[J].? Genomics，2015，105（5-6）：288-295.

[22]Lee J，Izzah N K，Choi B S，et al.Genotyping-by-sequencing map permits identification of clubroot resistance QTLs and revision of the reference genome assembly in cabbage （Brassica oleracea L.）[J]. DNA Research，2016，23（1）：29-41.

[23]Ipek A，Ipek M，Ercisli S，et al.Transcriptome-based SNP discovery by GBS and the construction of a genetic map for olive[J].? Functional & Integrative Genomics，2017，17（5）：493-501.

[24]Jo J，Purushotham P M，Han K，et al. Development of a genetic map for onion （Allium cepa L.） using reference-free genotyping-by-sequencing and SNP assays[J]. Frontiers in Plant Science，2017，8：1606.

[25]Li X，Kong C C，Yu H L，et al. Identification of a major QTL for seed number per silique in cabbage （Brassica oleracea L. var. capitata） using genotyping by sequencing[J].? Euphytica，2019，215（7）：UNSP 133.

[26]Carrasco B，Gonzalez M，Gebauer M，et al. Construction of a highly saturated linkage map in Japanese plum （Prunus salicina L.） using GBS for SNP marker calling[J].? PLoS One，2018，13（12）：e0208032.

[27]賴國榮，張靜，劉函，等. 基于GBS構建玉米高密度遺傳圖譜及營養(yǎng)品質性狀QTL定位[J]. 農業(yè)生物技術學報，2017，25（9）：1400-1410.

[28]Diouf L，Pan Z E，He S P，et al. High-density linkage map construction and mapping of salt-tolerant QTLs at seedling stage in upland cotton using genotyping by sequencing （GBS）[J]. International Journal of Molecular Sciences，2017，18（12）：2622.

[29]Bhattarai U，Subudhi P K.Identification of drought responsive QTLs during vegetative growth stage of rice using a saturated GBS-based SNP linkage map[J]. Euphytica，2018，214（2）：38.

[30]Zhang L，Guo D L，Guo L L，et al.Construction of a high-density genetic map and QTLs mapping with GBS from the interspecific F1 population of P. ostii ‘Fengdan Bai and P. suffruticosa ‘Xin Riyuejin[J].? Scientia Horticulturae，2019，246：190-200.

[31]Gabay G，Dahan Y，Izhaki Y，et al. High-resolution genetic linkage map of European pear （Pyrus communis） and QTL fine-mapping of vegetative budbreak time[J].? BMC Plant Biology，2018，18（1）：175.

[32]Passianotto A L D，Sonah H，Dias W P，et al.Genome-wide association study for resistance to the southern root-knot nematode （Meloidogyne incognita） in soybean[J]. Molecular Breeding，2017，37（12）：1-11.

[33]郭 燕，喬大河，楊 春，等.基于全基因組SNP的貴州久安古茶樹遺傳關系分析[J]. 植物遺傳資源學報，2019，20（1）：26-36.

[34]Gerardo N L，Cristóbal B，Catalina P，et al.High-density genetic map and QTL analysis of soluble solid content，maturity date，and mealiness in peach using genotyping by sequencing[J]. Scientia Horticulturae，2019，2579（17 ）：108734.

[35]高美玲，梁曉雪，劉秀杰，等.基于極端個體GBS測序初步定位西瓜果形基因[J]. 分子植物育種，2020，18 （10）：3164- 3171.

[36]楊 柳，周鶴瑩，薄文浩，等.基于選擇清除分析鑒定影響棗果實大小的基因[J]. 北京林業(yè)大學學報，2019，41（10）：30-36.

[37]Guajardo V，Solis S，Sagredo B，et al.Construction of high density sweet cherry（Prunus avium L.） linkage maps using microsatellite markers and snps detected by genotyping-by-sequencing （GBS）[J].? PLoS One，2015，10（5）：e0127750.

[38]Zhou Z，Zhang C，Zhou Y，et al. Genetic dissection of maize plant architecture with an ultra-high density bin map based on recombinant inbred lines[J].? BMC Genomics，2016，17：178.

[39]Celik I，Bodur S，F(xiàn)rary A，et al.Genome-wide SNP discovery and genetic linkage map construction in sunflower （Helianthus annuus L.） using a genotyping by sequencing （GBS） approach[J]. Molecular Breeding，2015，36（9）：133，

[40]Lee J，Izzah N K，Choi B S，et al.Genotyping-by-sequencing map permits identification of clubroot resistance QTLs and revision of the reference genome assembly in cabbage （Brassica oleracea L.）[J].? DNA Research，2016，23（1）：29-41.

[41]Bielenberg D G，Rauh B，F(xiàn)an S H，et al.Genotyping by sequencing for SNP-based linkage map construction and QTL analysis of chilling requirement and bloom date in peach [Prunus persica （L.） Batsch[J].? PLoS One，2015，10（10）：e0139406.

[42]Gardner K M，Brown? P，Cooke T F，et al. Fast and cost-effective genetic mapping in apple using next-generation sequencing[J]. G3 （Bethesda），2014，4（9）：1681-1687.

[43]Manickavelu A，Jighly A，Ban T.Molecular evaluation of orphan Afghan common wheat （Triticum aestivum L.） landraces collected by Dr. Kihara using single nucleotide polymorphic markers[J]. BMC Plant Biology，2014，14（1）：320.

[44]Nimmakayala P，Tomason Y R，Abburi V L，et al.Genome-wide differentiation of various melon horticultural groups for use in GWAS for fruit firmness and construction of a high resolution genetic map[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：1437.

[45]Tanhuanpaa P，Erkkila M，Tenhola-Roininen T，et al.SNP diversity within and among Brassica rapa accessions reveals no geographic differentiation[J].? Genome，2016，59（1）：11-21.

[46]Ashraf B H，Byrne S，F(xiàn)e D，et al. Estimating genomic heritabilities at the level of family-pool samples of perennial ryegrass using genotyping-by-sequencing[J].? Theoretical and applied Genetics，2016，129（1）：45-52.

[47]Pavan S，Lotti C，Marcotrigiano A，et al. A distinct genetic cluster in cultivated chickpea as revealed by genome-wide marker discovery and genotyping[J]. Plant Genome，2017，10（2）：1-9.

[48]Otto L G，Mondal P，Brassac J，et al. Use of genotyping-by-sequencing to determine the genetic structure in the medicinal plant chamomile，and to identify flowering time and alpha-bisabolol associated SNP-loci by genome-wide association mapping[J]. BMC Genomics，2017，18（1）：1-18.

[49]Kumar S，Kirk C，Deng C，et al.Genotyping-by-sequencing of pear （Pyrus spp.） accessions unravels novel patterns of genetic diversity and selection footprints[J]. Horticulture Research，2017，4（1）：17015.

[50]蔡 露，楊 歡，王 勇，等.利用GBS技術開發(fā)煙草SNP標記及遺傳多樣性分析[J]. 中國煙草科學，2018，39（5）：17-24.

[51]Wang X，Bao K，Reddy U K，et al.The USDA cucumber （Cucumis sativus L.） collection：genetic diversity，population structure，genome-wide association studies，and core collection development[J].? Horticulture Research，2018，5（1）：64.

[52]Lee S R，Gaskin J F，Kim Y D. Molecular diagnosis for a Tamarix species from two reclaimed lands along the Yellow Sea in Korea inferred from genome wide SNP markers[J].? Journal of Systematics and Evolution，2018，57（3）：247-255.

[53]Ryu J，Kim W J，Im J，et al.Single nucleotide polymorphism （SNP） discovery through genotyping-by-sequencing （GBS） and genetic characterization of Dendrobium mutants and cultivars[J].? Scientia Horticulturae，2019，244：225-233.

[54]Upadhyaya H D，Vetriventhan M，Deshpande S P，et al.Population genetics and structure of a global foxtail millet germplasm collection[J].? Plant Genome，2015，8（3）：1-13.

[55]Ertiro B T，Ogugo V，Worku M，et al. Comparison of kompetitive allele specific PCR （KASP） and genotyping by sequencing （GBS） for quality control analysis in maize[J].? BMC Genomics，2015，16（1）：908.

[56]Chitwood J，Shie A N，Mou B Q，et al.Population structure and association analysis of bolting，plant height，and leaf erectness in spinach[J].? Hortscience，2016，51（5）：481-486.

[57]Wiersma A T，Pulman J A，Brown L K，et al. Identification of Pm58 from Aegilops tauschii[J].? Theoretical and Applied Genetics，2017，130（6）：1123-1133.

[58]董艷輝，宇鳳，溫鑫，等.基于高通量測序的藜麥連作根際土壤微生物多樣性研究[J]. 華北農學報，2019，34（2）：205-211.

[59]Liu X P，Yu L X.Genome-wide association mapping of loci associated with plant growth and Forage production under salt stress in alfalfa （Medicago sativa L.）[J]. Frontiers in Plant Science，2017，8：853.

[60]Zaid I U，Tang W J，Liu E B，et al. Genome-wide single-nucleotide polymorphisms in CMS and restorer lines discovered by genotyping using sequencing and association with marker-combining ability for 12 yield-related traits in Oryza sativa L. subsp japonica[J]. Frontiers in Plant Science，2017，8：143.

[61]Kang Y J，Lee B M，Nam M，et al.Identification of quantitative trait loci associated with flowering time in perilla using genotyping-by-sequencing[J]. Molecular Biology Reports，2018，46（4）：4397-4407.

[62]Hussain W，Baenziger P S，Belamkar V，et al.Genotyping-by-sequencing derived high-density linkage map and its application to QTL mapping of flag leaf traits in bread wheat[J].? Scientific Reports，2017，7（1）：1-15.

[63]Bajgain P，Rouse M N，Tsilo T J，et al. Nested association mapping of stem rust resistance in wheat using genotyping by sequencing[J]. PLoS One，2016，11（5）：e0155760.

[64]de Leon T B，Linscombe S，Subudhi P K. Molecular dissection of seedling salinity tolerance in rice （Oryza sativa L.） using a high-density GBS-based SNP linkage map[J].? Rice，2016，9（1）：52.

[65]Moncada M D，Tovar E，Montoya J C，et al.A genetic linkage map of coffee （Coffea arabica L.） and QTL for yield，plant height，and bean size[J]. Tree Genetics & Genomes，2016，12（1）：5.

[66]McClure K A，Gardner K M，Toivonen P M A，et al.QTL analysis of soft scald in two apple populations[J]. Horticulture Research，2016，3：16043.

[67]Qi H K，Wang N，Qiao W Q，et al.Construction of a high-density genetic map using genotyping by sequencing （GBS） for quantitative trait loci （QTL） analysis of three plant morphological traits in upland cotton （Gossypium hirsutum L.）[J]. Euphytica，2017，213（4）：83.

[68]Ravelombola W，Qin J，Shi A N，et al.Association mapping revealed SNP markers for adaptation to low phosphorus conditions and rock phosphate response in USDA cowpea [Vigna unguiculata （L.） Walp.] germplasm[J]. Euphytica，2017，213（8）：14.

[69]Shimray P W，Bajaj D，Srivastava R，et al.Identifying transcription factor genes associated with yield traits in chickpea[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2017，35（5）：562-574.

[70]Zhang J P，Long Y，Wang L M，et al.Consensus genetic linkage map construction and QTL mapping for plant height-related traits in linseed flax （Linum usitatissimum L.）[J].? BMC Plant Biology，2018，18（1）：1-12.

[71]Gali K K，Liu Y，Sindhu A，et al.Construction of high-density linkage maps for mapping quantitative trait loci for multiple traits in field pea （Pisum sativum L.）[J]. BMC Plant Biology，2018，18：172.

[72]Talukder Z I，Long Y M，Seiler G J，et al.Introgression and monitoring of wild Helianthus praecox alien segments associated with Sclerotinia basal stalk rot resistance in sunflower using genotyping-by-sequencing[J]. PLoS One，2019，14（3）：e0213065.

[73]Perez-de-Castro A，Esteras C，Alfaro-Fernandez，et al.Fine mapping of wmv1551，a resistance gene to Watermelon mosaic virus in melon[J].? Molecular Breeding，2019，39（7）：93.劉艷艷，曹婷，劉興華，等. 32份粳稻骨干親本抗稻瘟病基因的分子檢測[J]. 江蘇農業(yè)科學，2020，48（13）：69-72.doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2020.13.013